朱丹丹，江世貴，黃建華，周發(fā)林，楊其彬，姜 松，楊麗詩

( 1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 深圳試驗(yàn)基地，廣東 深圳 518108 )

斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)，屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼動(dòng)物亞門、十足目、枝鰓亞目、對蝦科、對蝦屬，是對蝦屬中的最大型種。斑節(jié)對蝦的人工繁育過程一直以人工授精為主，但此方法會(huì)受到多種外界因素的影響，導(dǎo)致受精成功率及受精卵質(zhì)量下降，因此目前針對斑節(jié)對蝦性腺成熟規(guī)律的研究已成為人工繁育技術(shù)創(chuàng)新的重要突破口。

盡管對甲殼動(dòng)物的性腺成熟過程的研究已較多[1-4]，并且在人類、果蠅等模式生物成熟細(xì)胞系的水平上也進(jìn)行了較為深入的研究[5-6]，但因?yàn)閷ξr成熟細(xì)胞系的缺失，諸多結(jié)論無法在對蝦的細(xì)胞水平上進(jìn)行驗(yàn)證，因此如果能建立起斑節(jié)對蝦的性腺組織成熟細(xì)胞系，將有助于對斑節(jié)對蝦性腺成熟調(diào)控機(jī)制的探索和驗(yàn)證。

迄今為止，有不少國內(nèi)外專家學(xué)者對對蝦組織細(xì)胞體外培養(yǎng)進(jìn)行了研究和探索，如Chen等[7]首次進(jìn)行了斑節(jié)對蝦卵巢組織的原代培養(yǎng)，并且成功傳至3代；胡珂等[8]對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)肝胰腺組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，傳代至28代；Luedeman等[9]使用了10種培養(yǎng)基配方對藍(lán)對蝦(Penaeusstylirostris)和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的卵巢組織進(jìn)行了培養(yǎng)；Hsu等[10]利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子等使淋巴器官的細(xì)胞傳至90代，并建立了有限細(xì)胞系；王立平等[11]將中國明對蝦甲殼下上皮組織細(xì)胞傳代至25代。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，即便是針對同一種對蝦，報(bào)道的培養(yǎng)條件也不同，無法確定體外組織細(xì)胞存活所需的最適條件，原代培養(yǎng)的成功率也較低，永生性的細(xì)胞株一直未能建立，但已有一些利用培養(yǎng)出的離體組織進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究的報(bào)道，如李國鵬[12]證實(shí)，MAPK信號通路在原代培養(yǎng)斑馬魚(Daniorerio)卵母細(xì)胞的成熟過程中起到了關(guān)鍵作用；Jose等[13]以原代培養(yǎng)的斑節(jié)對蝦淋巴組織為基礎(chǔ)，探究了白斑綜合征病毒與細(xì)胞的作用關(guān)系及相關(guān)免疫基因的表達(dá)情況；韓萍等[14]利用斑節(jié)對蝦卵巢組織的離體培養(yǎng)初步探究了多種促性腺激素釋放激素對卵母細(xì)胞的影響。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，為更進(jìn)一步了解不同培養(yǎng)方法和不同培養(yǎng)基配方對斑節(jié)對蝦離體組織和細(xì)胞的生長、形態(tài)、活力及基因表達(dá)的影響，通過比較在3種改良培養(yǎng)基和2種處理方法(酶解法和機(jī)械分離法)下的細(xì)胞生長情況、活力變化規(guī)律以及原代培養(yǎng)狀態(tài)下MAPK信號通路相關(guān)基因的表達(dá)變化情況，對培養(yǎng)過程中細(xì)胞和基因的變化規(guī)律進(jìn)行探索，以期對斑節(jié)對蝦性腺組織和細(xì)胞的原代培養(yǎng)過程進(jìn)行初步優(yōu)化，從而通過提高性腺細(xì)胞存活率，建立成熟高效的原代組織及細(xì)胞培養(yǎng)體系，為建立斑節(jié)對蝦原代細(xì)胞研究平臺(tái)提供支持?jǐn)?shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

斑節(jié)對蝦取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，充氧運(yùn)回廣州實(shí)驗(yàn)室，雌蝦3尾，體質(zhì)量30～50 g，雄蝦2尾，體質(zhì)量20～30 g，體色正常、健康有活力，用充分曝氣的自來水和海水晶配制人工海水，鹽度15，水溫(20±3) ℃，連續(xù)充氣暫養(yǎng)1 d[15]。

1.2 組織培養(yǎng)材料

1.2.1 培養(yǎng)基

取1包Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基粉末(Invitrogen)，加入500 mL電阻率為18.2 MΩ·cm超純水(Millipore公司)，配置成2×L-15培養(yǎng)基母液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后高壓滅菌備用。

以2×L-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加15%胎牛血清(Invitrogen)及相應(yīng)無機(jī)鹽溶液配置出3種試驗(yàn)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為7.2，具體培養(yǎng)基配方見表1。

1.2.2 其他培養(yǎng)用溶液

100×PSN(三抗，Gibco)，胎牛血清(Gibco)，0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA，Gibco)；配制7.5 g/L NaCl，5 g/L NaCl，1 g/L 葡萄糖，0.32 g/L KCl，1.02 g/L MgCl2，0.49 g/L MgSO4，2 g/L CaCl2溶液，均使用18.2 MΩ·cm的超純水配置，充分溶解后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，高壓滅菌備用。

表1 培養(yǎng)基配方

1.3 試驗(yàn)方法

將斑節(jié)對蝦先用0.1%高錳酸鉀溶液充氧浸泡20 min，再用70%乙醇對體表進(jìn)行2次消毒，最后用含1% PSN的Dulbecco磷酸鹽緩沖液(Gibco)沖洗2～3次。取出卵巢(側(cè)葉部分)及精巢組織，將性腺組織在75%乙醇中快速漂洗1次，然后轉(zhuǎn)移至無菌Dulbecco磷酸鹽緩沖液中漂洗至少2次，用眼科剪剪碎成約1 mm3的組織小塊，根據(jù)以下處理方法分為2組：

(1)機(jī)械分離組：用巴斯德吸管進(jìn)行機(jī)械吹打, 使組織塊分散成游離細(xì)胞團(tuán)，之后均勻接種在加入不同完全培養(yǎng)基的96孔板中。

(2)酶解組：使用0.1%胰蛋白酶(由含有1%PSN的Dulbecco磷酸鹽緩沖液稀釋)在室溫黑暗的環(huán)境下消化組織塊10～20 min后終止酶解反應(yīng)，經(jīng)過80孔目的細(xì)胞篩多次過濾后加入完全培養(yǎng)液，吹打均勻后接種在加入不同完全培養(yǎng)基的96孔板中。

每個(gè)處理分別設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行。之后將培養(yǎng)板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)后觀察并更換培養(yǎng)基，之后每2 d更換50%培養(yǎng)液。

1.4 試驗(yàn)樣品采集與處理

每隔24 h觀察、記錄細(xì)胞生長情況。分別在接種24、72、120 h后取出部分樣品進(jìn)行蘇木精—伊紅染色切片的制作、細(xì)胞活力的檢測以及基因表達(dá)定量試驗(yàn)cDNA模板的制作。

(1)蘇木精—伊紅染色切片制備：將取出的部分卵巢或精巢組織小塊置于波恩氏固定液中固定過夜，經(jīng)流水沖洗及70%～100%梯度酒精脫水后，使用1∶1乙醇二甲苯透明，經(jīng)過浸蠟包埋后過夜放置，進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚4 μm，取其中一張切片進(jìn)行蘇木精—伊紅染色。

(2)細(xì)胞活力檢測：按照全式金公司的TransDetect? Cell Counting Kit 說明書，用培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在96孔板中接種100 μL細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)量在2×103個(gè)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，之后每孔加CCK溶液10 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)。5000 r/min離心5 min，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光值并記錄結(jié)果。

(3)基因表達(dá)定量：按照Megan公司HiPure Total RNA Plus Kits試劑盒(No.R4122)提取斑節(jié)對蝦性腺細(xì)胞培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)樣品的總RNA，提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定其完整度，經(jīng)分光光度計(jì)測定含量及純度。使用上海寶生物公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(No.RR047)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為熒光定量PCR的模板。在Roche Lightcycler 480熒光定量PCR儀(Roche，USA)中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序設(shè)計(jì)為：95 ℃預(yù)變性40 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增EF-1α作為內(nèi)參，其他基因的定量引物設(shè)計(jì)見表2。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對ΔCt法 (2-ΔΔCt法)計(jì)算各組樣品中的相對表達(dá)量，顯著性檢驗(yàn)利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，采用單因素方差分析和多重比較分析數(shù)據(jù)，P<0.05為差異顯著。

表2 試驗(yàn)中所用引物序列

2 結(jié)果及分析

2.1 受試樣品發(fā)育分期確定

參照文獻(xiàn)[14,18-19]的方法對斑節(jié)對蝦性腺分期情況進(jìn)行判定。所解剖的斑節(jié)對蝦卵巢組織呈嫩黃色，組織切片顯示，卵巢內(nèi)含有大量處于核染色質(zhì)期或核仁周期的卵原細(xì)胞和初級卵母細(xì)胞致密排列(圖1)，符合卵黃發(fā)生前期的形態(tài)特征，判定本試驗(yàn)用雌蝦卵巢處于Ⅱ期。同時(shí)所解剖的斑節(jié)對蝦精巢組織呈白色，組織切片可見4種類型的細(xì)胞(圖2)，精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞較致密排列，據(jù)此判定本試驗(yàn)用雄蝦精巢處于成熟期。

圖1 卵巢Ⅱ期切片a～c依次為放大10倍，200倍及400倍; Oo.卵原細(xì)胞，Po.初級卵母細(xì)胞.

圖2 精巢切片a～c依次為放大10倍，200倍及400倍；SG.精原細(xì)胞，PSC.初級精原細(xì)胞，SSC.次級精原細(xì)胞，ST.精子細(xì)胞.

2.2 不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)觀察及切片觀察

2.2.1 酶解法樣品的細(xì)胞形態(tài)觀察

酶解后使用80目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，除單個(gè)游離的卵巢細(xì)胞外，仍有部分細(xì)胞團(tuán)懸浮。接種1 d后即可見細(xì)胞團(tuán)的周圍有大量細(xì)胞游離(圖3a)，2～3 d后可見部分細(xì)胞出現(xiàn)分裂相，隨著細(xì)胞培養(yǎng)的繼續(xù)，到第5 d時(shí)，部分組織塊開始松散，出現(xiàn)細(xì)胞破裂、數(shù)量減少，1號和2號培養(yǎng)基的情況相對較好。

精巢組織酶解后可見大量分散的細(xì)胞，2～3 d后細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞團(tuán)減小，細(xì)胞出現(xiàn)貼壁生長的現(xiàn)象(圖3b)，部分精原細(xì)胞開始發(fā)生形態(tài)變化，細(xì)胞種類增多，到第5 d，細(xì)胞呈貼壁生長，但部分細(xì)胞出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，其中1號和2號培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)較為完整。

2.2.2 采用機(jī)械分離法處理的細(xì)胞形態(tài)觀察

機(jī)械分離接種后24、72、120 h取組織塊樣品進(jìn)行蘇木精—伊紅染色切片觀察(圖4)。0 h時(shí)可見卵原細(xì)胞致密排列，24 h時(shí)各組的細(xì)胞變化不大，出現(xiàn)少量的分裂相卵母細(xì)胞。72 h后各組出現(xiàn)較大變化，2號培養(yǎng)基少量細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)固縮，1號培養(yǎng)基處理組有部分細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)固縮的形態(tài)，卵母細(xì)胞排列開始變松散，3號培養(yǎng)基細(xì)胞破裂和凋亡較嚴(yán)重，卵母細(xì)胞減少，120 h時(shí)1、2號培養(yǎng)基染色質(zhì)固縮的程度有一定加深，細(xì)胞加劇分散，但仍可見正常的卵母細(xì)胞，而3號培養(yǎng)基幾乎看不到正常的卵母細(xì)胞，視野中為大量的亮藍(lán)色濃集細(xì)胞核，細(xì)胞核碎片狀，邊集。直至第7 d時(shí)，2號培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組織中仍有少數(shù)活細(xì)胞。

精巢的蘇木精—伊紅染色切片中可以看到，1號培養(yǎng)基和2號培養(yǎng)基中的組織在試驗(yàn)第5 d時(shí)仍然保持一定形態(tài)及細(xì)胞完整度，但3號培養(yǎng)基的組織形態(tài)完全消散(圖5)。

圖3 酶解法處理后的斑節(jié)對蝦性腺細(xì)胞a.雌蝦卵巢細(xì)胞，b.雄蝦精巢細(xì)胞.

圖4 雌蝦卵巢組織蘇木精—伊紅染色切片a.1號培養(yǎng)基，b.2號培養(yǎng)基，c.3號培養(yǎng)基.下同.

圖5 雄蝦精巢組織蘇木精—伊紅染色切片

2.3 不同培養(yǎng)條件下中的細(xì)胞活力的變化

酶解法和機(jī)械分離法進(jìn)行原代培養(yǎng)對卵母細(xì)胞和精原細(xì)胞活力的影響見圖6。1號培養(yǎng)基細(xì)胞活力普遍高于另外2種培養(yǎng)基，其中3號培養(yǎng)基的細(xì)胞活力相對較低。在1號培養(yǎng)基處理下，酶解法和機(jī)械分離法對精原細(xì)胞活力影響不大，均在離體培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到頂峰，72 h以后逐漸下降，而酶解法培養(yǎng)的卵母細(xì)胞活力均高于機(jī)械分離法，并在72 h后仍然具有較高活力；2號培養(yǎng)基條件下，酶解法和機(jī)械分離法對精原細(xì)胞活力影響相似，而酶解法的卵母細(xì)胞活力高于機(jī)械分離法，各組別在培養(yǎng)后0～72 h逐漸上升，在120 h后維持平衡；3號培養(yǎng)基條件下，酶解法的細(xì)胞活力顯著高于機(jī)械分離法，0～72 h細(xì)胞活力逐漸升高，至72 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降，而機(jī)械分離法不能提高精原細(xì)胞的活力，更降低了卵母細(xì)胞活力。

2.4 不同培養(yǎng)條件下的MAPK信號通路相關(guān)基因的表達(dá)量變化

在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中，MAPK信號通路相關(guān)基因的表達(dá)均不同(圖7)。雌蝦中c-Mos基因表達(dá)量最高，分別比Ras、ERK、MEK1的表達(dá)量高約27倍、10倍、11倍，雄蝦中也是如此，分別比Ras、ERK、MEK1的表達(dá)量高約17倍、21倍、25倍。

圖6 雌雄蝦在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞活力變化情況

圖7 不同培養(yǎng)基中的雌、雄蝦的MAPK信號通路相關(guān)基因表達(dá)量的變化情況

1號培養(yǎng)基中，雌蝦的Ras基因的表達(dá)量在72 h時(shí)顯著上調(diào)，120 h時(shí)顯著下降，2、3號培養(yǎng)基中，72 h時(shí)顯著上調(diào)，但低于1號培養(yǎng)條件下的表達(dá)量，隨后在120 h時(shí)下降，但高于1號培養(yǎng)條件下該時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；ERK基因的表達(dá)量在1號培養(yǎng)基中是逐漸上調(diào)的，在2號培養(yǎng)基中變化不大，在3號培養(yǎng)基中72 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后下調(diào)，且同時(shí)間點(diǎn)里3種培養(yǎng)基的表達(dá)量均差異顯著(P<0.05)；MEK1基因的表達(dá)量在1號和2號培養(yǎng)基中無顯著變化，但在3號培養(yǎng)基中顯著降低；c-Mos基因的表達(dá)量在不同培養(yǎng)基中表達(dá)變化趨勢相似，即72 h時(shí)有所上調(diào)，120 h達(dá)到表達(dá)高峰，但1號、2號培養(yǎng)基中c-Mos基因的上調(diào)表達(dá)變化高于3號培養(yǎng)基中的表達(dá)量。

雄蝦中的Ras基因在1號培養(yǎng)基中72 h時(shí)上調(diào)至最高，隨后下降，而在2號和3號培養(yǎng)基中在72 h時(shí)下調(diào)至最低，隨后略有上升，但均未達(dá)顯著水平；ERK基因的表達(dá)量在1號培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后下降，120 h時(shí)顯著下降，2號、3號培養(yǎng)基中也在72、120 h下降，但未達(dá)顯著水平；MEK1基因在1號培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h時(shí)上升，隨后下降，在2、3號培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h時(shí)下降，隨后維持低水平或上升，但均未達(dá)顯著水平。c-Mos基因在3種培養(yǎng)基中均是72 h下調(diào)后120 h顯著上調(diào)，同時(shí)上調(diào)幅度依次為1號培養(yǎng)基>2號培養(yǎng)基>3號培養(yǎng)基。

3 討 論

在過去的幾十年中，很多研究團(tuán)體和個(gè)人致力于建立持續(xù)的蝦細(xì)胞系，但均未獲得成功。斑節(jié)對蝦的原代細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)在鰓[7]、淋巴組織[9]、卵巢[14]、心臟[16]、肝胰腺[17]等多種組織器官上進(jìn)行了探索，獲得了關(guān)于培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基配方等方面的結(jié)論。本試驗(yàn)分別在機(jī)械分離法和酶解法條件下，采用3種改良型培養(yǎng)基培養(yǎng)斑節(jié)對蝦性腺組織及細(xì)胞，以便探索不同培養(yǎng)方法和不同培養(yǎng)基下培養(yǎng)的組織、細(xì)胞的狀態(tài)、活力及相關(guān)基因表達(dá)的變化。

3.1 不同培養(yǎng)方法下細(xì)胞的生長情況

目前動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)主要采用機(jī)械分離法和消化法。機(jī)械分離法是取所需組織用剪刀或手術(shù)刀剪切成 1 mm3的碎塊，再經(jīng)培養(yǎng)基或平衡鹽溶液清洗后分散植入培養(yǎng)瓶，均勻接種于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)或密閉培養(yǎng)的過程[20]。如Chen等[7]使用機(jī)械分離的方法進(jìn)行了斑節(jié)對蝦淋巴器官原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，而韓萍等[14]用組織培養(yǎng)法觀察了促性腺激素釋放激素對離體卵巢發(fā)育的影響。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，機(jī)械分離法可以成功進(jìn)行體外精原和卵母細(xì)胞的培養(yǎng)，但在不同培養(yǎng)條件下差異較大。其中在1號培養(yǎng)基中，即僅有L-15培養(yǎng)基的情況下，機(jī)械分離的精原細(xì)胞活力較強(qiáng)，與酶解的差別不大，但3號培養(yǎng)基條件下對精原細(xì)胞的活力幾乎沒有影響。消化法是使用胰蛋白酶(含EDTA)、膠原酶或透明質(zhì)酸酶對組織和細(xì)胞進(jìn)行消化解離。其中，胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的基質(zhì)蛋白水解從而使細(xì)胞離散，但不同的組織或者細(xì)胞對胰蛋白酶的作用反應(yīng)不一樣。劉凱于等[16-17]的斑節(jié)對蝦試驗(yàn)結(jié)果表明，胰蛋白酶的消化使肝胰腺、血淋巴等細(xì)胞無法在體外正常存活，或?qū)@些細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大損傷。使用胰蛋白酶處理日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)淋巴組織細(xì)胞，即使在低含量、低溫度、短作用時(shí)間下淋巴組織細(xì)胞也依然無法存活[21]。這說明對蝦細(xì)胞對于胰蛋白酶的作用是高度敏感的。但張巖等[22]使用胰蛋白酶酶解的方法成功觀察到了紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)XO-SG的單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，這可能是因?yàn)樯窠?jīng)中含有大量結(jié)締組織，不易被胰蛋白酶酶解。

本試驗(yàn)利用胰蛋白酶分別酶解卵巢和精巢組織后發(fā)現(xiàn)，酶解后培養(yǎng)的精原細(xì)胞活力在3種不同培養(yǎng)基條件下均近于或高于機(jī)械分離方法。卵巢和精巢均具有少量結(jié)締組織，被胰蛋白酶消化后使得原代性腺細(xì)胞團(tuán)發(fā)生分散。

本研究結(jié)果表明，酶解法亦適用于對蝦細(xì)胞培養(yǎng)，在特定培養(yǎng)條件下，比機(jī)械分離法效果更好。因此，酶解法與機(jī)械分離法應(yīng)該根據(jù)具體試驗(yàn)進(jìn)行選擇，機(jī)械分離法易于操作，可以適用于對組織的影響變化試驗(yàn)，而酶解法適用于觀察單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)變化、蛋白定位等試驗(yàn)。

3.2 不同培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長情況

目前對蝦細(xì)胞培養(yǎng)主要還是采用改良的哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，如MEM、RPMI、L-15、M199、Grace液等。其中L-15及M199已證明能很好地支持對蝦細(xì)胞的生長。如Chen等[7]發(fā)現(xiàn)，L-15作為基本培養(yǎng)基培養(yǎng)的斑節(jié)對蝦卵巢原代細(xì)胞可以進(jìn)行3次傳代，2×L-15培養(yǎng)基較1×L-15培養(yǎng)基的培養(yǎng)情況更為理想。韓萍等[14]也利用L-15作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基成功培養(yǎng)了離體斑節(jié)對蝦卵巢組織。

本試驗(yàn)1號培養(yǎng)基直接使用2×L-15作為基本培養(yǎng)基，通過顯微觀察和切片觀察發(fā)現(xiàn)，其對保持斑節(jié)對蝦卵母細(xì)胞和精原細(xì)胞的形態(tài)維持和生長均具有促進(jìn)作用。2號培養(yǎng)基添加了葡萄糖作為碳源，并添加一定含量的Na+來調(diào)控滲透壓，對細(xì)胞生長有良好促進(jìn)作用，細(xì)胞活力在0～72 h得到提高，并在120 h時(shí)仍保持較高的細(xì)胞活力水平，這提示，滲透壓對原代培養(yǎng)的性腺細(xì)胞的生長和增殖具有重要意義。3號培養(yǎng)基在2號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上又添加了K+、Mg2+、Ca2+離子，卻對細(xì)胞生長無顯著促進(jìn)作用，相反，對細(xì)胞活力有一定的抑制作用。這與之前的報(bào)道相似，因此推測，由于斑節(jié)對蝦屬廣鹽性海洋甲殼類動(dòng)物，長期適應(yīng)環(huán)境中劇烈的滲透壓變化，具有較強(qiáng)的離子調(diào)節(jié)功能，但離體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基的滲透壓通過簡單地添加無機(jī)鹽難以調(diào)節(jié)至蝦體自身的滲透壓，于是可能抑制了組織或細(xì)胞的生長，但有研究顯示，若添加對蝦自身的組織提取液或淋巴液及各類生長因子可以優(yōu)化對蝦細(xì)胞的生長情況，但對細(xì)胞生長、分裂均無明顯的幫助[23-24]。

本試驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，卵巢的組織團(tuán)塊和分散細(xì)胞在培養(yǎng)的5 d里，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各培養(yǎng)基中的組織都開始出現(xiàn)破碎、變形的情況，但是2號培養(yǎng)基中相較于1、3號培養(yǎng)基，組織發(fā)生變化的速度較慢，直至第7 d時(shí)，組織中仍有少數(shù)活細(xì)胞(圖4)。精巢的組織團(tuán)塊接種時(shí)就可見大量分散細(xì)胞分布在培養(yǎng)板上，2～3 d后細(xì)胞數(shù)量增多，組織塊減小，細(xì)胞出現(xiàn)貼壁生長的現(xiàn)象，部分精原細(xì)胞開始發(fā)生形態(tài)變化，細(xì)胞種類增多，至第5 d時(shí)，1號培養(yǎng)基和2號培養(yǎng)基中的組織仍然保持一定形態(tài)及細(xì)胞完整度，但3號培養(yǎng)基的組織完全失去活性。離體培養(yǎng)過程中，雖然培養(yǎng)時(shí)間短，但有些細(xì)胞依然能分裂和生長。這是由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞中包含的細(xì)胞種類較多，大部分細(xì)胞因具有不同的生長潛力而出現(xiàn)細(xì)胞死亡，只剩下少數(shù)細(xì)胞(主要是成纖維樣細(xì)胞)能夠存活且具備分裂的能力，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞活力下降，可能引起了細(xì)胞的凋亡。

3.3 細(xì)胞活力的變化情況

原代培養(yǎng)試驗(yàn)的細(xì)胞活力比值結(jié)果顯示，酶解后的細(xì)胞與機(jī)械分離后的細(xì)胞相比具有更高活力，卵巢及精巢的細(xì)胞活力比值相差較大。在電子耦合試劑1-Methoxy PMS存在的情況下，CCK試劑中的水溶性四唑鹽可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成橙黃色甲臜，而死細(xì)胞則無此功能，甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量呈正比，因此細(xì)胞活力的上升或下降可能由細(xì)胞增殖或死亡等引起。離體培養(yǎng)過程中雖然培養(yǎng)時(shí)間短，但隨著細(xì)胞培養(yǎng)的進(jìn)行，細(xì)胞不僅發(fā)生著分裂增殖，也發(fā)生著凋亡死亡，兩種過程同時(shí)發(fā)生，因此細(xì)胞的活力比值會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)，但當(dāng)細(xì)胞生長穩(wěn)定后，細(xì)胞活力比值就會(huì)趨于動(dòng)態(tài)平衡。而原代培養(yǎng)細(xì)胞一般會(huì)包含多種細(xì)胞，大部分細(xì)胞會(huì)因?yàn)樯L潛力不同而出現(xiàn)細(xì)胞死亡，只剩下少數(shù)細(xì)胞(主要是成纖維樣細(xì)胞)能夠存活且具備分裂的能力[25]。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞無法形成完整的能量供給，可能引起細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致活力下降。對蝦卵巢Ⅱ期細(xì)胞種類較多，細(xì)胞發(fā)育時(shí)期不統(tǒng)一，中央卵管內(nèi)的卵圓細(xì)胞增殖減弱，卵黃發(fā)生前期卵母細(xì)胞處于發(fā)育中，并逐漸充滿卵室，而精巢已處于成熟期，細(xì)胞形態(tài)及種類較為穩(wěn)定，本試驗(yàn)的結(jié)果也顯示，在培養(yǎng)前期細(xì)胞種類雜亂，細(xì)胞活力比值低，而后期，由于細(xì)胞種類減少，細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞開始正常生長增殖，細(xì)胞活力比值穩(wěn)定或升高。

3.4 MAPK信號通路的變化情況

機(jī)體發(fā)育和細(xì)胞生長與MAPK信號通路密切相關(guān)，其中的ERK信號通路被證明參與生物體的多種生理病理過程，如參與性腺的生長發(fā)育、細(xì)胞再生及細(xì)胞分化[26-27]。促有絲分裂刺激因子(如生長因子、細(xì)胞因子)激活了位于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體、G蛋白偶聯(lián)受體等相關(guān)受體后，通過小GTP蛋白家族Ras蛋白或相關(guān)蛋白的介導(dǎo)激活Raf激酶家族成員，并依次磷酸化MEK1/2和ERK1和ERK2。c-Mos參與了磷酸化MEK1/2的過程。

通過檢測MAPK信號通路關(guān)鍵因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的MAPK信號通路被激活，由于ERK-MEK1存在相互作用，其變化趨勢差別不顯著，而MAPK信號通路上游基因c-Mos激活效果顯著，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，c-Mos上調(diào)水平顯著。同時(shí)在1號、2號培養(yǎng)基中c-Mos的上調(diào)水平高于3號培養(yǎng)基處理下的水平。提示c-Mos是與細(xì)胞生長呈正相關(guān)的基因，可以考慮作為指示細(xì)胞培養(yǎng)情況的基因。Mos蛋白是存在于生殖細(xì)胞中的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，在卵母細(xì)胞生長發(fā)育過程中積累，因此該蛋白在卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂中扮演著重要角色，尤其在遇到促性腺發(fā)育因子刺激后會(huì)被大量合成，激活卵母細(xì)胞，使其進(jìn)入MⅡ期，之后又開始發(fā)生降解消化。本試驗(yàn)中，c-Mos基因在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的7～17 h，表達(dá)量降低至起始的18%～43%，這也印證了MⅠ期到MⅡ期的轉(zhuǎn)化[28]。在豬卵母細(xì)胞中的c-Mos基因表達(dá)量在卵母細(xì)胞被激活后也會(huì)迅速降低，卵母細(xì)胞的成熟也受到了刺激[29]。培養(yǎng)72 h時(shí)，培養(yǎng)的性腺細(xì)胞可能正在經(jīng)歷MⅠ期到MⅡ期的轉(zhuǎn)化，卵母細(xì)胞被激活過程。而c-Mos原癌基因在小鼠附睪的區(qū)域特異性表達(dá)及定位也提示，c-Mos基因可能在精子成熟過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[30]。因此，本試驗(yàn)檢測的不同培養(yǎng)基中的多種MAPK信號通路重要因子的時(shí)空分布結(jié)果證實(shí)了MAPK信號通路與細(xì)胞的增殖死亡過程相關(guān)。

總之，本試驗(yàn)以L-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過3種不同培養(yǎng)基配方考察了酶解法和機(jī)械分離法對斑節(jié)對蝦的性腺細(xì)胞的離體培養(yǎng)效果。通過觀察細(xì)胞及蘇木精—伊紅染色的組織切片，測定3種培養(yǎng)基下的細(xì)胞活力值，發(fā)現(xiàn)酶解法同樣適用于斑節(jié)對蝦性腺細(xì)胞離體培養(yǎng)，1、2號培養(yǎng)基在一定培養(yǎng)條件下優(yōu)于3號培養(yǎng)基。