趙麗麗，包煥玲，姜永新，劉圣臣，劉佳亮，曹學彬

( 山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺 264003 )

低聚果糖又稱蔗果低聚糖或果寡糖，是由1～3個果糖基通過β(2-1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。作為一種天然活性物質(zhì)，低聚果糖質(zhì)量穩(wěn)定，不易被內(nèi)源酶消化，能夠促進腸道雙歧桿菌(Bifidobacterium)的增殖，促進鈣吸收，增強機體免疫力[1-4]，目前已被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、保健品以及動物飼料中，被譽為抗生素時代后最具潛力的新一代添加劑—促生物質(zhì)。研究表明，飼料中添加低聚果糖，可顯著提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[5]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[6]的生長性能，提升銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[7]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[8]的非特異性免疫能力。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)，屬棘皮動物門、海參綱，具有較高的食用與藥用價值，是我國名貴的海珍品之一[9]。近年來，隨著仿刺參需求量的增大，其增養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速。然而，由于對仿刺參的抗逆性研究不足，在遭遇病害或自然災害時，往往會造成大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。仿刺參無特異性免疫系統(tǒng)，機體關(guān)鍵防御機制受細胞免疫應(yīng)答和非細胞的體液應(yīng)答調(diào)節(jié)[10]。已有研究表明，飼料中添加殼寡糖和低聚木糖等寡糖類物質(zhì)可顯著提高仿刺參的生長性能和免疫能力[11-13]。低聚果糖是目前已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化的寡糖類物質(zhì)，而其在仿刺參配合飼料中應(yīng)用尚未見報道。筆者以仿刺參為研究對象，通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的低聚果糖，研究其對仿刺參生長、體成分及機體生長免疫因子的影響，旨在為仿刺參的健康養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配方及制作

以藻粉和發(fā)酵豆粕為主要原料，設(shè)計粗蛋白含量約40%的基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%的菊芋低聚果糖(≥95%，凡秘能特種糖業(yè)有限公司)，并設(shè)對照組(不添加低聚果糖)，制作6組等氮、等能的試驗飼料，飼料配方及基本成分見表1。

各固體原料超微粉碎過200目標準篩，按配比稱量質(zhì)量，逐級混勻。將飼料和海泥(3∶7)充分混勻，加入適量蒸餾水后，用小型飼料擠壓機擠壓成條形飼料，稍微晾曬后，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料配方及基本組成(干基) %

注：a.多維、多礦參見文獻[13].

1.2 試驗設(shè)計與養(yǎng)殖管理

試驗開始前，試驗用仿刺參于圓柱形養(yǎng)殖水槽中馴養(yǎng)2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料。正式試驗開始之前，禁食24 h，挑選體質(zhì)健壯，規(guī)格整齊，初始質(zhì)量約20 g的仿刺參720頭，隨機分布到18個藍色圓柱形水槽中(高80 cm，直徑80 cm)。試驗分為6個處理，每個處理3個重復，每個重復放養(yǎng)30頭仿刺參，每種飼料隨機投喂3個水槽。

日投喂1次(17:00)，投喂量為仿刺參初始體質(zhì)量的10%，觀察仿刺參攝食情況，調(diào)整次日投喂量。采用氣石進行微充氣，每日采用虹吸法將殘餌、糞便吸出后，換水約50%。養(yǎng)殖試驗持續(xù)14周。試驗期間水溫15.2～18.4 ℃，鹽度26～29，溶解氧>5 mg/L。試驗在弱光環(huán)境中進行。

1.3 樣品采集與分析

試驗結(jié)束后，禁食48 h，記錄每桶仿刺參的數(shù)量并稱量質(zhì)量，計算存活率、質(zhì)量增加率和特定生長率；每桶隨機取10頭仿刺參，解剖分離體壁和腸道，分別置于-20 ℃保存待測。剩余仿刺參繼續(xù)投喂2周后，每桶隨機取5頭，用無菌注射器自背部刺入體腔，吸取體腔液，3000 r/min離心10 min后，吸取上清液，保存于-80 ℃待測。

成活率/%=n/30×100%

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

特定生長率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，n為試驗末仿刺參數(shù)量(頭)，m1為試驗初仿刺參均質(zhì)量(g)，m2為試驗末仿刺參均質(zhì)量(g)，t為試驗時間(d)。

飼料及仿刺參樣品中水分用105 ℃烘干至恒定質(zhì)量法測定(GB/T 6435—2006)，粗蛋白用凱氏定氮法測定(GB/T 6432—2006)，粗脂肪用索氏抽提法測定(GB/T 6433—2006)，粗灰分用550 ℃損失質(zhì)量法測定(GB/T 6438—2007)，氨基酸參照GB/T 14924.10—2008，采用全自動氨基酸測定儀(Hitachi L-8900，日本)測定，總糖依據(jù)文獻[14]測定。

腸道4 ℃解凍后，按1∶9(m∶V)加入預冷的蒸餾水后，冰浴勻漿5 min后，3000 r/min離心10 min，吸取上清液待測。

體腔液中生長激素、補體C3、補體C4、一氧化氮合酶及腸道勻漿液中丙酮酸激酶、己糖激酶含量采用ELISA試劑盒(上海紀寧實業(yè)有限公司)測定，測定方法及活力單位設(shè)定見說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著時(P<0.05)采用Duncan氏檢驗進行多重比較分析。統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標準差的形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 低聚果糖對仿刺參生長性能的影響

低聚果糖對仿刺參生長性能的影響見表2。由表2可知，飼料中添加低聚果糖對試驗仿刺參的成活率無顯著影響(P>0.05)。試驗仿刺參的質(zhì)量增加率和特定生長率隨低聚果糖含量的增加呈先升后降的趨勢，均在0.80%試驗組達到最高值(P<0.05)。

以質(zhì)量增加率為評價指標，經(jīng)一元二次回歸分析，體質(zhì)量約20 g的仿刺參配合飼料中低聚果糖的適宜添加量為0.55%(圖1)。

表2 低聚果糖對仿刺參生長性能的影響

注：同行上標英文字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同.

圖1 仿刺參質(zhì)量增加率與飼料低聚果糖含量的曲線回歸分析

低聚果糖對仿刺參階段性生長的影響見表3。由表3可見，對照組、0.20%試驗組仿刺參前6周生長無顯著差異，顯著低于其他各組，其他各組之間無顯著差異；試驗6～10周，0.20%試驗組仿刺參質(zhì)量增加顯著高于對照組，但仍低于其他組；試驗10周后，1.00%組仿刺參質(zhì)量增加率下降，12周時與0.20%試驗組無顯著差異，14周時與對照組、0.20%組均無顯著差異。

以體質(zhì)量與養(yǎng)殖時間對仿刺參生長速率進行回歸，仿刺參的生長速率符合一元二次曲線，且隨著低聚果糖添加量的增加，曲率逐漸降低；以△增加質(zhì)量與養(yǎng)殖時間對仿刺參生長速率進行回歸，對照組，0.20%～0.60%試驗組仿刺參生長速率符合對數(shù)函數(shù)曲線，0.80%、1.00%試驗組仿刺參生長速率符合一元二次曲線，且曲率均為負值(表4)。

2.2 低聚果糖對仿刺參體壁成分的影響

低聚果糖對仿刺參體壁成分的影響見表5。由表5可見，低聚果糖對仿刺參體壁水分和粗脂肪含量無顯著影響，粗蛋白及粗灰分含量有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，總糖含量隨飼料低聚果糖含量的增加而增加，1.00%試驗組比對照組含量提高了11.58%和29.27%(P<0.05)。

表3 低聚果糖對仿刺參階段性生長的影響 g

表4 低聚果糖對仿刺參生長速率的影響

注：ym為每次取樣時仿刺參的體質(zhì)量，xt為養(yǎng)殖時間，y△m為每次取樣時仿刺參的質(zhì)量增加量.

表5 低聚果糖對仿刺參體壁基本成分的影響 %

注：*粗蛋白、粗脂肪、粗灰分及總糖均為干基含量.

低聚果糖對仿刺參體壁氨基酸的影響見表6。由表6可見，仿刺參體壁中甘氨酸、半胱氨酸及精氨酸隨低聚果糖含量的增加均呈先升后降的趨勢，分別在0.60%、0.80%、0.60%組達到最高，顯著高于對照組(P<0.05)；谷氨酸含量隨低聚果糖含量的升高呈先升高后平穩(wěn)的趨勢；飼料添加低聚果糖對仿刺參體壁其他氨基酸及總氨基酸含量無顯著影響(P>0.05)。

2.3 低聚果糖對仿刺參生長免疫因子的影響

低聚果糖對仿刺參生長免疫因子的影響見表7。由表7可見，體腔液中生長激素、補體C3、補體C4及一氧化氮合酶含量均隨低聚果糖的升高呈先升后降的趨勢，但腸道丙酮酸激酶和己糖激酶活力隨低聚果糖的升高而升高(P<0.05)。

表6 低聚果糖對仿刺參體壁氨基酸含量的影響 %

注：*為必需氨基酸.

表7 低聚果糖對仿刺參生長免疫因子的影響

3 討 論

3.1 飼料中添加低聚果糖對仿刺參生長的影響

低聚糖是一種新型功能性糖源，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、飲料、醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域[15]。低聚糖主要分為兩類：一類為普通低聚糖，具有易消化、低甜度、低滲透特性，可延長供能時間，增強肌體耐力，抗疲勞，如蔗糖、乳糖等；另一類為功能性低聚糖，這類糖進入大腸作為雙歧桿菌的增殖因子，能有效地促進雙歧桿菌的生長繁殖，抑制腐敗菌生長[16]，如低聚果糖、殼寡糖、低聚木糖等。功能性低聚糖是典型的益生元，其中殼寡糖和低聚木糖已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中，并取得了較好的應(yīng)用效果[17-19]。本試驗中，添加低聚果糖顯著提高了仿刺參的生長性能，與窄爪小龍蝦(Astacusleptodactylusleptodactylus)[20]和奧尼羅非魚[21]的研究結(jié)果一致。與殼寡糖和低聚木糖類似[12-13]，低聚果糖促進仿刺參生長的機理與其增殖腸道雙歧桿菌、促進腸道蠕動、促進礦物元素吸收等功能有關(guān)。本試驗中，仿刺參的生長與飼料中低聚果糖的含量呈現(xiàn)顯著的劑量反應(yīng)效應(yīng)，當?shù)途酃翘砑恿窟^低(≤0.20%)或過高(≥0.80%)時，仿刺參質(zhì)量增加率均低于中間添加量組(0.20%～0.80%)。從生長速率分析，隨著低聚果糖添加量的增加，仿刺參的生長速率逐漸降低，尤其是0.80%及1.00%試驗組的生長速率趨于0甚至是負值，表明二者后期仿刺參的生長速度低于不添加組。Shiau等[22]報道了飼料中添加殼寡糖(≥2.00%)會抑制奧尼羅非魚生長；而黃燕華等[23]研究表明，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的質(zhì)量增加率與飼料中低聚木糖含量(≤0.05%)呈正相關(guān)。有研究報道，低聚糖類能吸附金屬離子[24]，與蛋白質(zhì)、脂類等結(jié)合[25]，過量添加會直接阻礙機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。由此可見，功能性低聚糖類在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用需嚴格控制添加量。

3.2 飼料中添加低聚果糖對仿刺參體壁基本成分的影響

本試驗中，仿刺參體壁基本成分含量未受低聚果糖含量的影響，但Barbara等[26]研究表明，低聚果糖降低了大西洋鮭(Salmosalar)全魚粗蛋白含量。這可能與養(yǎng)殖動物的食性、低聚果糖添加量、養(yǎng)殖時間等有關(guān)。同時有研究表明，添加殼寡糖或低聚木糖等功能性低聚糖，對仿刺參[12]、大菱鲆[27]、奧尼羅非魚[28]的體成分均無顯著影響。本試驗中，仿刺參體壁粗灰分含量有升高的趨勢，與飼料中低聚果糖促進鈣的吸收有關(guān)[4]，未達顯著水平，可能與仿刺參生長環(huán)境中鈣離子含量較為豐富有關(guān)。低聚果糖顯著提高了仿刺參體壁中總糖的含量，與白陽[14]的研究中殼寡糖能提高仿刺參體壁中總糖含量的結(jié)果類似。

本試驗中，低聚果糖提高了仿刺參體壁中谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和精氨酸的含量。目前尚無關(guān)于低聚果糖改變機體氨基酸組成的報道，但白陽[14]的研究表明，殼寡糖可顯著提高仿刺參體壁中膠原蛋白的含量，而甘氨酸和谷氨酸含量分別占仿刺參膠原蛋白中總氨基酸含量的1/3和1/10[29]，因此本試驗中仿刺參體壁中甘氨酸和谷氨酸含量的增加，可能是低聚果糖增加了仿刺參體壁膠原蛋白的含量所致。

3.3 飼料中添加低聚果糖對仿刺參生長免疫因子的影響

生長激素是機體內(nèi)最重要的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在代謝和促生長方面發(fā)揮著重要作用[30]，能調(diào)節(jié)水生動物的滲透壓[31]。目前在棘皮動物中尚未見關(guān)于生長激素的相關(guān)報道，但Matthew等[32]在仿刺參體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)促甲狀腺激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素等激素的前體，預示著仿刺參體內(nèi)存在著內(nèi)分泌系統(tǒng)。本試驗的仿刺參體腔液中生長激素含量與褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)血漿中生長激素含量[31]相差無幾，但仿刺參體腔液處于開放的循環(huán)系統(tǒng)中，其激素的分泌與調(diào)控值得深入研究。

目前已經(jīng)證實仿刺參體內(nèi)存在補體系統(tǒng)[33]，且補體活力的大小與其疾病抵抗能力密切相關(guān)[34]。本試驗中所測得仿刺參體腔液中補體C3和補體C4含量顯著低于中華鱉(Pelodiscussinensis)[35]和團頭魴(Megalobramaamblycephala)[36]，這與試驗動物與測定方法的不同有關(guān)。仿刺參體腔液中補體C3及補體C4與低聚果糖均存在劑量反應(yīng)效應(yīng)，說明低聚果糖能通過激活補體系統(tǒng)，提高仿刺參的免疫能力。

一氧化氮合酶是催化L-精氨酸裂解成L-瓜氨酸和一氧化氮的酶，是仿刺參體內(nèi)重要的免疫指標之一[14,37]。本試驗中，一氧化氮合酶活力隨低聚果糖添加量的增加呈先升后降的趨勢，說明低聚果糖對仿刺參的免疫有刺激作用。仿刺參體腔細胞體外試驗表明，褐藻寡糖可提升一氧化氮合酶活力[38]；但低聚果糖可增殖機體內(nèi)雙歧桿菌，而雙歧桿菌可引起整體免疫應(yīng)答的特異抗原、影響腸道黏膜免疫細胞群的數(shù)量及分布[39]。因此，不同寡糖類物質(zhì)提高機體免疫能力的機理可能存在差異。

丙酮酸激酶和己糖激酶是生物體糖代謝的關(guān)鍵酶，二者活力升高表明機體糖代謝活躍。本試驗中，仿刺參腸道丙酮酸激酶和己糖激酶活力均隨低聚果糖含量的增加而增大，表明低聚果糖的添加促進了仿刺參體內(nèi)糖代謝。低聚果糖是由果糖基通過β(2-1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的寡糖，從結(jié)構(gòu)與生理功能分析，其促進糖代謝的原因可能有兩方面：(1)仿刺參體內(nèi)存在β(2-1)糖苷鍵水解酶，可直接利用低聚果糖；(2)低聚果糖通過增殖體內(nèi)有益菌群，產(chǎn)生糖類代謝物，促進體內(nèi)糖代謝。通常來講，生物體內(nèi)缺乏β(2-1)糖苷鍵水解酶，因此低聚果糖促進仿刺參糖代謝的原因更傾向于后者，但目前尚缺乏直接證據(jù)。

4 結(jié) 論

飼料中添加適量的低聚果糖可以促進仿刺參生長，提高體壁總糖含量，增強機體免疫能力。以質(zhì)量增加率為評價指標，仿刺參飼料中低聚果糖適宜添加量為0.55%。