編譯 凌寒

利用CRISPR和其他工具，科學(xué)家正在對DNA甲基化、組蛋白標記和其他基因表達調(diào)節(jié)劑進行修飾，以了解它們是如何影響到健康與疾病的。

在美國加州拉霍亞索爾克研究所胡安·貝爾蒙特（Juan Carlos Izpisua Belmonte）實驗室里，科學(xué)家對疾病相關(guān)基因進行微調(diào)后，罹患腎病、肌萎縮或糖尿病的突變小鼠的健康狀況均有所改善。然而，貝爾蒙特和他的同事們并沒有編輯這些基因本身。相反，他們靶向表觀基因組，對位于染色質(zhì)上的化學(xué)和蛋白質(zhì)標簽進行修飾，從而影響了基因表達。

科學(xué)家正在開發(fā)分子工具來編輯這些表觀遺傳標記，揭示它們是如何影響基因組非編碼區(qū)域并控制基因表達的。更好地理解表觀基因組如何行使其功能，才會給從癌癥到膽固醇升高等帶來新的、更安全的疾病治療方法。杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程師查爾斯·格斯巴赫（Charles Gersbach）表示：“表觀基因組編輯真的不同于基因組編輯，通過它你可以做很多非?？岬氖虑?。”

盡管基因組編輯具有革命性的前景，但它也有一些弊端。例如，它改變了細胞的基礎(chǔ)DNA序列，可能會產(chǎn)生意料之外的效果，導(dǎo)致癌癥或其他疾病。表觀遺傳編輯不會改變DNA序列，這就使其作為一種療法更為安全。此外，基因組編輯依賴于DNA修復(fù)通路，該通路會以一種不可預(yù)知的方式將新的堿基插入到遺傳密碼中。表觀基因組編輯并不切割DNA，也不需要縫合堿基來對其進行修復(fù)，這使得工具的使用在細胞類型上更加一致，格斯巴赫說。

然而，設(shè)計表觀基因組編輯器也有自己的挑戰(zhàn)。其一，就是表觀遺傳標記物組蛋白的生化多樣性——組蛋白尾端有著甲基、乙?；约捌渌δ芙M，DNA上的甲基原子團本身就有至少6種不同的形式，而每年發(fā)現(xiàn)的更多類型的標志物使得設(shè)計出剛好合適的靶向每個單獨的標記而不引發(fā)副作用的編輯器變得更加困難。加州理工學(xué)院遺傳工程學(xué)家邁克爾·埃洛維茨（Michael Elowitz）表示，由于對表觀遺傳調(diào)控背后的分子機制尚不十分清楚，精確靶向位于基因組特定位點的表觀遺傳標記物仍然十分困難，“目前，盡管我們有著豐富的分子學(xué)知識儲備，但是系統(tǒng)背后的基本邏輯還是難以理解?！?/p>

在這里，開發(fā)出表觀基因組編輯工具的研究人員為《科學(xué)家》雜志介紹了他們的工作。

表觀遺傳開關(guān)

研究員安吉洛·隆巴多（Angelo Lombardo），遺傳學(xué)家，圣拉斐爾特利松基因治療研究所

項目沉默基因世代表達

問題20年來，研究人員一直在使用RNA干擾技術(shù)來抑制信使RNA后轉(zhuǎn)錄，ZFNs或TALENs這些人工核酸酶通過靶向雙鏈斷裂來擾亂DNA序列，從而下調(diào)或關(guān)閉特定基因的表達。但這些方法只能部分敲除靶基因，或者無法敲除靶基因的所有等位基因。有時候它們根本沒有擊中正確的基因。

解決方案真核細胞天生就會使用表觀遺傳來抑制基因表達。該過程的一個便于理解的機制涉及在胚胎植入子宮前，其干細胞中所謂的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（源于遠古逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的基因組碎片）的關(guān)閉。為了關(guān)閉剩余的病毒元件，細胞用到了兩種特殊的蛋白質(zhì)家族，包含鋅指蛋白的Kr üppel相關(guān)盒子（KRAB-ZFP）和DNA從頭甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）。前者與病毒序列相結(jié)合，并將甲基和乙?；鶑慕M蛋白標記物中移除。后者添加甲基原子團，鎖定未來細胞世代的基因抑制。

隆巴多和他的同事利用這一機制，從這兩個蛋白質(zhì)家族（他們選用了KRAB-ZFP/KAP1和DNMT3A）中分別選取一種蛋白質(zhì)進行改造，以關(guān)閉分化的人類細胞（如T細胞）中的基因，而不是干細胞中的基因。研究人員將這兩種蛋白質(zhì)與DNA序列配對，這些序列會引導(dǎo)它們對三個特定基因的表觀遺傳標記施展神通，從而有效地關(guān)閉這些基因。由于每種蛋白質(zhì)靶向的表觀遺傳標記略有不同，因此這兩種蛋白質(zhì)將以不同的方式編輯表觀基因組。其中一種蛋白質(zhì)迅速、穩(wěn)健且可逆地抑制了基因的表達，而這種抑制作用經(jīng)過幾輪細胞分裂后即可消除。另一種蛋白質(zhì)也關(guān)閉了這三個基因，這種抑制作用持續(xù)了很長時間，只有在經(jīng)歷幾百代的細胞世代后才會消失。一年后，在細胞持續(xù)分裂的情況下，這些抑制標記仍是穩(wěn)定的，這一事實確實令人印象深刻，格斯巴赫說道。他并未參與這項研究。

身份轉(zhuǎn)換：利用CRISPR-Cas9修飾的表觀遺傳標記物，研究人員將特定基因上調(diào)，使成纖維細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元

疾病的發(fā)現(xiàn)

研究員查爾斯·格斯巴赫，生物醫(yī)學(xué)工程師，杜克大學(xué)

項目利用經(jīng)過修飾的基因編輯工具繪制癌癥的非編碼DNA圖譜

問題人類基因組中數(shù)百萬個區(qū)域并不編碼蛋白質(zhì)。其中一些非編碼區(qū)域攜帶有與白血病、乳腺癌和其他復(fù)雜疾病相關(guān)的序列變異，但這些基因組片段如何對基因表達進行調(diào)控尚不清楚。研究人員已經(jīng)利用CRISPR-Cas9基因組編輯對某些基因和調(diào)控元件進行干預(yù)，以探索它們對健康的影響，但這種技術(shù)并不適用于所有的基因變體，也不能正確地修飾控制它們的調(diào)控元件。格斯巴赫指出，更重要的是這項技術(shù)只能關(guān)閉而不能打開基因，而且它仍然依賴于在遺傳密碼中插入或刪除DNA。

解決方案格斯巴赫和他的同事設(shè)計出了一種基于CRISPR-Cas9的表觀基因組編輯器，在該編輯器中，Cas9發(fā)生突變不再切割DNA，而是與修飾表觀基因組的蛋白質(zhì)片段相融合。這些蛋白質(zhì)片段定位于非編碼DNA區(qū)域，這些區(qū)域被稱為啟動子或增強子，并招募表觀遺傳元件來誘導(dǎo)或抑制DNA轉(zhuǎn)錄。

研究小組在人類細胞中使用編輯器來阻斷啟動b-球蛋白基因座和HER2基因座上基因轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域。b-球蛋白基因座與白血病有關(guān)，而HER2基因座似乎會在乳腺癌中發(fā)揮作用。在癌細胞和胚胎腎細胞中完成的實驗結(jié)果證實，之前已知的調(diào)控區(qū)域確實能夠控制這些基因位點上的基因表達。用向?qū)NA靶向所有候選基因調(diào)控元件，然后對比它們在表達高水平或低水平HER2的細胞基因組中不同位點的豐度，也揭示了之前未被識別的調(diào)控HER2表達的非編碼區(qū)域。使用編輯器打開這些非編碼區(qū)域顯示出了一個更令人驚訝的結(jié)果：非編碼區(qū)域的激活是具有某些細胞類型特異性的，如癌細胞或來自特定器官的細胞，因此，也是具有特定疾病特異性的?！拔覀兓旧鲜抢帽碛^基因組編輯的方法來探索并繪制非編碼基因組圖譜的?！备袼拱秃照f道。

肌肉構(gòu)建器：與未接受治療的小鼠（左）相比，經(jīng)過基因工程改造患有肌肉萎縮癥的小鼠，其體內(nèi)基于Cas9的表觀遺傳基因激活增加了肌肉質(zhì)量和脛骨前肌纖維的大小（右）

治療性編輯

研究員胡安·貝爾蒙特，細胞生物學(xué)家，索爾克生物研究所

項目靶向基因表達以治療疾病

問題對CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行修飾以靶向特定的甲基化標記和組蛋白修飾而不切割DNA的嘗試，已經(jīng)在細胞培養(yǎng)中取得了相對成功，但將該項工作轉(zhuǎn)化到活體動物身上具有挑戰(zhàn)性。部分原因是因為CRISPR-Cas9系統(tǒng)過于龐大，無法進入細胞核，而表觀遺傳標記的編輯就是在細胞核中進行的。

解決方案貝爾蒙特和他的團隊著手創(chuàng)造了一個更小的表觀遺傳編輯器。他們有一個激進的想法：為什么不把編輯器一分為二呢？一部分由一個腺相關(guān)病毒攜帶，將包含Cas9酶；另一部分由第二個腺相關(guān)病毒攜帶，將轉(zhuǎn)運向?qū)NA和基因開關(guān)。這兩部分將共同作用來上調(diào)或下調(diào)基因的表達。

研究小組使用該工具在活體小鼠體內(nèi)上調(diào)了三種基因——治療腎病的Klotho基因、治療肌肉萎縮癥的Utrophin基因和為糖尿病生產(chǎn)胰島素的Pdx1基因。上調(diào)這些基因可以補償疾病相關(guān)的基因突變，改善小鼠模型中這些疾病的癥狀。研究人員還利用該工具表達了某些長鏈非編碼RNA以及富含鳥嘌呤和胞嘧啶的基因，這些基因很難被測序，揭示了它們的生物學(xué)功能。貝爾蒙特說：“我們的論文證明了用表觀遺傳學(xué)方法治療疾病是可能的。”

控制膽固醇

研究員查爾斯·格斯巴赫，生物醫(yī)學(xué)工程師，杜克大學(xué)

項目阻抑基因表達以降低膽固醇

問題PCSK9基因編碼了一種可以調(diào)節(jié)，并且有時還可以阻止血液中LDL（壞的）膽固醇的清除的蛋白質(zhì)。一種抑制該蛋白以促進LDL清除的抗體藥物已經(jīng)被批準用于治療家族性高膽固醇血癥。家族性高膽固醇血癥是一種遺傳性疾病，該病患者體內(nèi)的PCSK9蛋白無法清除血液中的LDL。其他正在開發(fā)的治療方法旨在利用人工合成寡核苷酸或基因編輯來抑制該基因的表達。由于人們對PCSK9及其與膽固醇的關(guān)系做了大量的研究，因此科學(xué)家們對它的表達知之甚多。這一基礎(chǔ)有助于建立一個可調(diào)節(jié)它的表觀基因組編輯器，格斯巴赫說道。通過使用基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的標準工具，格斯巴赫和他的同事能夠輕而易舉地通過靶向培養(yǎng)細胞中的特定表觀遺傳標記來關(guān)閉Pcsk9。但是，正如貝爾蒙特的團隊所經(jīng)歷過的那樣，讓這個工具在動物模型中起作用更加困難。

解決方案當使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)時，研究人員通常會從諸如釀膿鏈球菌等物種中提取細菌免疫系統(tǒng)。但是表觀遺傳編輯工具并不總是適合標準的腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)。因此，研究小組使用了來自金黃色葡萄球菌的Cas9系統(tǒng)；基因編輯軟件由一組比釀膿鏈球菌小1 000個堿基的基因編碼而成，并且更適合與向?qū)NA及其他分子一起在遞送系統(tǒng)中修飾基因表達。

正如貝爾蒙特的研究小組所做的那樣，格斯巴赫和他的同事們創(chuàng)造了兩套遞送系統(tǒng)，將表觀基因組編輯器運送到活的小鼠細胞基因組中的正確區(qū)域。其中一個系統(tǒng)攜帶來自于金黃色葡萄球菌的非DNA切割版Cas9以及能夠編輯表觀遺傳標記的蛋白質(zhì)片段，另一個系統(tǒng)則包含靶向Pcsk9基因的向?qū)NA。當研究小組將該雙管齊下的系統(tǒng)注射到成年小鼠體內(nèi)并對其肝細胞進行檢測時，小鼠的LDL膽固醇水平低于接受安慰劑治療的小鼠。格斯巴赫說，與寡核苷酸或基因編輯相比，這種方法的一個潛在好處就是，它不涉及諸如切割DNA或引入外源肽等步驟，而這些步驟可能會降低效率或激發(fā)不必要的免疫反應(yīng)。

資料來源 The Scientist