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(1.北京工商大學食品學院,北京 100048; 2.湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司,湖南常德 415401)

在經(jīng)過物理方法的處理后,清湯型骨素的蛋白質(zhì)含量遠比鮮骨要高,可以達到35%,而鮮骨中僅有11%左右。目前,骨素在食品工業(yè)中有一定應(yīng)用,但因其風味不突出,尚有待改進。酶解法是常用的改善骨素風味的方法,能夠為利用骨素開發(fā)復合型熱反應(yīng)香精提供反應(yīng)基料。對高溫蒸煮后的骨蛋白進行酶解反應(yīng),能夠使蛋白質(zhì)長鏈斷開,形成較短的肽段,還能生成更多親水性的小分子氨基酸,從而提高骨素產(chǎn)品的營養(yǎng)價值[6]。孫紅梅等[7]對比了雞骨素及其酶解液進行美拉德反應(yīng)所得到產(chǎn)物的風味差異,最終確定熱反應(yīng)底物為雞骨素酶解液。肖作兵等[8]研究了胰蛋白酶對豬骨素的酶促水解,得到了酶解的最佳工藝條件為酶解時間7 h,溫度50 ℃,底物濃度為1∶1,pH7.5,加酶量0.7%。方端等[9]對酶法水解牛骨工藝進行了研究,并對酶解液風味進行了感官鑒定,得到最優(yōu)方案:牛骨經(jīng)90 ℃水浴條件下預(yù)處理30 min后,底物濃度設(shè)定為1∶14,初始pH6.6,溫度為40 ℃,動物蛋白酶與底物比10000 U/g的條件下,酶解牛骨粉2 h。李迎楠等[10]酶解牛骨采用復合動物蛋白酶,其添加量為15 mg/g,酶解4 h;風味蛋白酶添加量為10 mg/g,酶解2 h。目前研究多集中于酶解雞骨素[7,11]和豬骨素[8,12-14],直接酶解牛骨素的研究較少,對于不同酶酶解牛骨素制備美拉德反應(yīng)香精的氣味及滋味上的差異對比仍是空白。

本文采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),測定美拉德反應(yīng)香精中的揮發(fā)性風味物質(zhì),采用高效液相色譜儀測定氨基酸、核苷酸和肽分布等非揮發(fā)性呈味物質(zhì),闡述不同酶酶解對牛骨素制備美拉德反應(yīng)香精的風味影響,進而推動骨素產(chǎn)品在食品工業(yè)上的應(yīng)用,以期提高牛骨素產(chǎn)品價值,滿足食品企業(yè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清湯型牛骨素、牛肉酶解液、水解植物蛋白(HVP) 湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;復合蛋白酶(Protamex,47500 U/g)、復合風味蛋白酶500 MG(Flavourzyme,25000 U/g) 丹麥諾維信公司;木瓜蛋白酶PSM 500(60000 U/g) 比利時PSM有限公司;胰蛋白酶(豬胰,25000 U/g)、D-木糖、葡萄糖、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、硫胺素(VB1) 源葉生物科技有限公司;呈味核苷酸二鈉(I+G) 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司;C7～C30系列烷烴、2-甲基-3-庚酮、混合氨基酸標準品、核苷酸標準品(5′-CMP、5′-GMP、5′-IMP和5′-AMP)、肽標準品(甘氨酸、抑肽酶、細胞色素C、桿菌肽、谷胱甘肽) 美國Sigma公司。

賽多利斯BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,JI-1精密增力電動攪拌器 國華電器有限公司;YX-18DJ型YX系列手提式壓力滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS) 美國Supelco公司;7890A-7000B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司;Sniffer9000嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司;毛細管柱DB-wax及DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國J&W公司;1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Zorbax Eclipse-AAA柱、Agilent Eclipse XDB-C18柱 美國Agilent公司;TSK G2000 SWXL柱 日本Tosoh公司;FOSS KJELTEC 8400半自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛骨素酶解液的制備 牛骨素中的基本化合物指標見表7,參考相關(guān)文獻[15-17]。選擇蛋白酶、風味蛋白酶500 MG、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,以及四種酶的兩兩組合,在最適條件下酶解牛骨素,各骨素酶解條件見表1。通過預(yù)實驗證明,在最適條件下,分步加酶與雙酶在兩種酶較優(yōu)酶解條件下共同酶解的水解度差別并不大,這是由于骨素中鹽含量高,導致各類酶的酶解進程較為困難,各組酶解液的水解度差異較小。而且分步酶解用時近8 h,不符合大多數(shù)企業(yè)的工業(yè)化生產(chǎn)要求,過長的酶解時間也會導致脂類物質(zhì)的氧化哈敗和異味物質(zhì)增多的現(xiàn)象發(fā)生。為了簡化工業(yè)生產(chǎn)步驟,統(tǒng)一采取共同的酶解方式進行實驗。兩種酶不同的溫度則選擇兩種酶最佳酶解溫度范圍內(nèi)的溫度與pH,保證兩種酶都能夠進行酶解工作。在錐形瓶中準確稱取100 g牛骨素,加酶后放入水浴鍋中,利用精密增力電動攪拌器進行攪拌,充分酶解后在90 ℃水浴滅酶10 min,冰浴冷卻降溫后,立即進行水解度的測定及熱反應(yīng)香精的制備。為了圖表直觀性,統(tǒng)一采用S1～S10代表各種不同酶酶解得到的牛骨素酶解液制備出的熱反應(yīng)香精,酶和酶組合簡寫見表1。

表7 牛骨素中基本化合物含量表Table 7 The content of basic substances in bovine bone extract

表1 酶解牛骨素條件表Table 1 The condition of enzymatic hydrolysis of bovine bone extract

1.2.2 熱反應(yīng)香精的制備 通過參考相關(guān)文獻[18-19],并進行前期預(yù)實驗,得到美拉德反應(yīng)配方如下:牛骨素酶解液30 g,蒸餾水14 g,牛肉酶解液6 g,葡萄糖0.5 g,木糖1 g,半胱氨酸0.5 g,半胱氨酸鹽酸鹽0.4 g,VB10.5 g,HVP 5 g,I+G 0.5 g,在120 ℃熱反應(yīng)60 min。熱反應(yīng)結(jié)束后,冰浴冷卻降溫后,在4 ℃冰箱儲存24 h后進行氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜及高效液相色譜分析。

家庭是構(gòu)成社會的基本元素，家庭的生存狀態(tài)是社會發(fā)展水平的標志。以往的城鄉(xiāng)規(guī)劃關(guān)注企業(yè)勝于關(guān)注家庭，關(guān)注勞動力資源勝于關(guān)注勞動者本身。大量農(nóng)民工的出現(xiàn)，導致了農(nóng)村家庭的碎片化和離散化、留守人群關(guān)愛的缺失，以及遠程通勤造成經(jīng)濟負擔和資源的浪費等等。城鄉(xiāng)規(guī)劃應(yīng)從家庭的完整性、聚合性和生活質(zhì)量方面，對就業(yè)、居住和公共服務(wù)進行規(guī)劃，使城鄉(xiāng)聚落適宜于家庭生活，而非人口和勞動力集聚的空間。

1.2.3 水解度(DH)的測定 氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法進行測定[20]。準確吸取5 mL酶解液至容量瓶,稀釋至100 mL,取20 mL稀釋液加入60 mL蒸餾水混勻,在磁力攪拌器進行攪拌狀態(tài)下,用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH=8.2,加入10 mL甲醛溶液后繼續(xù)滴定至pH=9.2,記錄消耗的NaOH溶液體積。80 mL蒸餾水在相同條件下進行滴定,作為空白溶液。溶液中氨基酸態(tài)氮含量的計算公式為：

式中:x為溶液中氨基酸態(tài)氮的含量(g/100 g);V1為滴定樣品時pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V2為滴定空白溶液時,pH從8.2～9.2所消耗的NaOH溶液體積(mL);V3為參與反應(yīng)的稀釋液體積(mL);C為NaOH溶液濃度(C=0.05 mol/L)。

總蛋白質(zhì)含量通過FOSS半自動凱氏定氮儀進行測定[21]。消化程序為200 ℃消化30 min,升溫至420 ℃消化1 h。水解度的計算公式為：

DH(%)=(氨基酸態(tài)氮含量/總蛋白質(zhì)含量)×100

1.2.4 感官評價 感官鑒評小組由北京工商大學分子感官科學實驗室的12名成員(6男6女,年齡20～50歲)組成,每名小組成員均接受過至少400 h的感官訓練,并且均具有評價牛肉香精的經(jīng)驗,感官訓練標準溶液配制方法見表2。通過小組成員討論,肉味香精選擇從氣味及滋味兩方面進行評價,其中氣味包括肉香、烤香、焦糖香、焦糊味、硫臭味、腥味、酸味共7項指標;滋味包括酸味、甜味、苦味、鮮味、醇厚感和后味共6項指標,氣味及滋味評分標準見表3及表4。樣品用蒸餾水稀釋50倍,并打亂序號,用水浴鍋調(diào)整樣品溫度至37 ℃,品評員對樣品進行描述性風味感官鑒評并打分。感官指標的評分采用10分制,0分代表未感知,10分代表極強烈,強度逐漸增加[22]。

表2 感官訓練標準溶液配制方法Table 2 The preparation method of standard solution for sense training

表3 氣味感官評價標準表(分)Table 3 Sensory evaluation standard for flavor(score)

表4 滋味感官評價標準表(分)Table 4 Sensory evaluation standard for taste(score)

1.2.5 揮發(fā)性香氣化合物的提取、定性和定量

1.2.5.1 揮發(fā)性香氣化合物的提取 采用固相微萃取(solid-phase micro-extraction,SPME)方法對10種熱反應(yīng)香精的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行提取。在40 mL頂空瓶中加入10 g樣品,并打入濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮溶液1 μL作為內(nèi)標物,混勻后密封。將樣品置于55 ℃水浴中平衡20 min,插入固相微萃取纖維頭(DVB/CAR/PDMS),頂空吸附40 min。萃取結(jié)束后,立即將萃取頭插入氣相色譜儀前進樣口中進行熱解析,于250 ℃條件下解析5 min進樣。

兩種不同極性的毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)被用來進行化合物的分離與驗證,包括DB-wax(極性柱)和DB-5(非極性柱)。升溫程序如下:初始溫度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min 升溫到200 ℃,再以10 ℃/min升溫到230 ℃,保持3 min,共41 min。載氣為氦氣,流速1.2 mL/min,不分流進樣。質(zhì)譜條件:電子轟擊(electron impact,EI)離子源,電子能量為70 eV,傳輸線溫度280 ℃,四極桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z為40～450 amu。GC-O溫度設(shè)定為200 ℃,嗅聞過程中有濕潤蒸氣與氣味物質(zhì)一起通過嗅聞口進入鼻腔,以降低干燥空氣對鼻腔粘膜的傷害,每組嗅聞由5名以上嗅聞人員單獨進行嗅聞實驗,氣味描述記錄為每種氣味活性化合物至少三名嗅聞人員的相同描述。

1.2.5.2 揮發(fā)性香氣化合物的定性分析 通過3種方法共同對未知揮發(fā)性香氣化合物進行定性分析,對揮發(fā)性香氣化合物的RI值進行計算,并與文獻報道的氣味化合物保留指數(shù)(retention index,RI)[23]對比,NIST14軟件質(zhì)譜譜庫檢索,并進行嗅聞數(shù)據(jù)對比。RI值的計算公式如下。

式中,N為待測氣味化合物a左側(cè)出峰的正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù);n為a兩側(cè)的兩個烷烴之間相差的碳原子數(shù)(n=1);tR為相應(yīng)化合物的保留時間。

1.2.5.3 揮發(fā)性香氣化合物的定量分析 本實驗只需對比定量關(guān)系,因此選取內(nèi)標法進行半定量分析。

其中,Ci為被測化合物濃度(μg/μL);Cis為內(nèi)標濃度(μg/μL);Ai為未知化合物的色譜峰面積;Ais為內(nèi)標物的色譜峰面積。

1.2.6 氨基酸的測定 實驗采用Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)進行16種游離氨基酸(Asp、Ser、Glu、Gly、His、Thr、Ala、Tyr、Arg、Cys、Met、Val、Phe、Leu、Ile、Lys)的定量分析檢測,分離柱為Zorbax Eclipse-AAA,酶解液與香精樣品按1∶5 (v/v)以超純水稀釋,通過0.22 μm濾膜后,采用Henderson等[24]的方法,利用OPA和FMOC柱前衍生法進行測定。將16種氨基酸混合標準試劑(1 nmol/μL)將氨基酸用0.1 mol/L HCl稀釋配制成不同濃度的混標進樣,分別繪制標準曲線,計算各氨基酸濃度。

高效液相色譜(HPLC)條件:采用Zorbax Eclipse-AAA(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱;流動相:鹽相A:40 mmol·L-1NaH2PO4的水溶液,用NaOH調(diào)至pH7.8;有機相B:甲醇-乙腈-水溶液(45∶45∶10,V/V/V)。流速為1 mL/min。進樣量為1 μL。紫外檢測波長為338 nm。柱溫設(shè)置為40 ℃。

1.2.7 核苷酸的測定 核苷酸的測定參考Cho等[25]的方法,采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,外標法定量。酶解液與香精樣品按1∶5 (v/v)以超純水稀釋,通過0.22 μm濾膜。

HPLC條件:流動相:鹽相A:40 mmol/L KH2PO4,用H3PO4調(diào)pH=3.8;有機相B:10%甲醇-水溶液,流速為1 mL/min。進樣量為1 μL。紫外檢測波長為254 nm。柱溫設(shè)置為35 ℃。

1.2.8 肽分布的測定 采用凝膠色譜柱TSK gel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)對樣品的肽分子質(zhì)量分布進行測定。選用的標準品包括甘氨酸(75Da)、谷胱甘肽(307 Da)、細胞色素C(885 Da)、桿菌肽(1423 Da)、抑肽酶(6512 Da),制作分子量標準曲線,以確定肽分子質(zhì)量大致分布。

HPLC條件:流動相:20%乙腈水溶液,用甲酸調(diào)整pH3.0。流速0.5 mL/min。進樣量1 μL。紫外檢測波長為215 nm。柱溫設(shè)置為25 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯多量程試驗(Duncan’s multi-range test),每個實驗在相同條件下重復三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對牛骨素酶解液水解度(DH)及感官評價的影響

熱反應(yīng)香精的感官評價與DH的關(guān)系見圖1。從圖1中可以得到,S5(復合蛋白酶+復合風味蛋白酶)、S6(復合蛋白酶+胰蛋白酶)、S10(胰蛋白酶+木瓜蛋白酶)這三種組合酶解得到的DH較高,四種單酶酶解DH差別不大,在這四種酶中,復合風味蛋白酶為內(nèi)切酶,其余三種均為外切酶,外切酶與內(nèi)切酶的組合中,復合風味蛋白酶與復合蛋白酶配合最好,DH最高,而與胰蛋白酶和木瓜蛋白酶配合,均降低了DH。這可能由于只有復合蛋白酶和復合風味蛋白酶酶解條件最相似,能夠發(fā)揮最大功效,能夠配合發(fā)揮其最大效果。同時,DH的升降也與感官評價得分的高低呈現(xiàn)相似的趨勢,通過前期研究發(fā)現(xiàn),牛骨素DH在10%～15%范圍內(nèi),制備出的熱反應(yīng)香精風味最佳,在該范圍內(nèi),DH越高,感官評分也越高,復合蛋白酶和復合風味蛋白酶的組合氣味和滋味總分最高。

圖1 不同酶對牛骨素水解度(DH)與美拉德反應(yīng)香精感官評價的影響Fig.1 The influence of different enzymes on degree of hydrolysis of bovine bone extract and sensory evaluation for Maillard reaction flavorings

2.2 不同酶對熱反應(yīng)香精揮發(fā)性風味成分的影響

由于測定酶解液揮發(fā)性風味成分意義較小,故本實驗針對10種酶解液制備的熱反應(yīng)香精進行了固相微萃取協(xié)同GC-O-MS進行分析,共得到64種氣味物質(zhì)。對表5中的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,可以發(fā)現(xiàn),10種香精中呈現(xiàn)烤香味、肉香、焦糖香等典型的牛肉香精風味物質(zhì)的總量如表中最后一行所示,這些物質(zhì)包括文獻中已有報道的甲硫氨酸的Strecker降解醛3-甲硫基丙醛(煮土豆味)[26-27];脂肪氧化降解產(chǎn)物正辛醛和壬醛(脂味)[26-28];含硫氨基酸-半胱氨酸降解及美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的2-乙酰噻唑(烤香味)[26-27];半胱氨酸降解產(chǎn)生的硫化氫和還原糖脫水產(chǎn)物5-甲基-4-羥基-3(2H)呋喃酮反應(yīng)所形成的2-甲基-3-呋喃硫醇(肉味)[29-30];半胱氨酸降解釋放H2S,參與到美拉德反應(yīng)中形成呈肉香的揮發(fā)性含硫化合物糠硫醇(烤香味)[26-27];由2-甲基-3-呋喃硫醇形成的二硫醚類物質(zhì)雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚(烤肉味)[26-27]等。除此之外,還包括呈現(xiàn)強烈烤香的2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二甲基哌嗪,呈現(xiàn)焦糖香氣的甲基麥芽酚,這些物質(zhì)對于牛肉香精天然柔和的肉味和烤香、焦糖香氣都有不可或缺的作用,故也計算在內(nèi),作為計算肉味香精典型香氣化合物含量指標。在典型肉味香精香氣含量對比中,含量最高的是S9(復合風味蛋白酶+木瓜蛋白酶)的組合,高達75.49 ng/g,S5(復合蛋白酶+復合風味蛋白酶)組合含量居第二位,達到68.27 ng/g。在四種單酶肉味香精中S4(木瓜蛋白酶)牛骨素酶解液美拉德反應(yīng)后肉香味物質(zhì)含量較高,達到31.71 ng/g;S1(復合蛋白酶)酶解制得香精的肉香味物質(zhì)含量是最低的,僅9.32 ng/g。

表5 10種不同酶酶解制備熱反應(yīng)香精揮發(fā)性風味成分的GC-O-MS分析結(jié)果Table 5 GC-O-MS analysis of volatile flavor compounds in the preparation of thermal reaction flavor by 10 different enzymes

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.3 非揮發(fā)性呈味物質(zhì)分析

2.3.1 不同酶對氨基酸及滋味活性值(TAV,Taste active value)的影響 滋味活性值為樣品中測定的滋味化合物濃度與其在水中或簡單的溶解基質(zhì)中測量的閾值之比,TAV>1認為該化合物具有滋味活性[31]。滋味閾值數(shù)據(jù)通過查閱文獻得到[32]。熱反應(yīng)香精氨基酸分析結(jié)果及TAV值對比見表6。圖2～圖4展示了美拉德反應(yīng)香精與酶解液中呈現(xiàn)鮮味、甜味與苦味氨基酸的對比,蛋白酶單獨酶解及其與其他酶共同酶解的三種組合中,單獨利用復合蛋白酶(S1)酶解得到的酶解液中鮮味氨基酸含量是最少的,當加入了木瓜蛋白酶之后,二者共同酶解(S7)使美拉德反應(yīng)香精鮮味氨基酸大大增加,達到1.02 g/L,復合蛋白酶與復合風味蛋白酶組合(S5)對改善滋味也大有益處,美拉德反應(yīng)香精鮮味氨基酸達到0.99 g/L;苦味氨基酸總量中,復合風味蛋白酶單獨酶解得到的酶解液,其苦味氨基酸含量遠高于其他,在配合了其他酶之后,苦味氨基酸含量大大降低。在10種香精的制備過程中,均加有半胱氨酸和半胱氨酸鹽酸鹽,這兩種氨基酸作為美拉德反應(yīng)的重要前體物,是制備熱反應(yīng)香精過程中所必需的,但由于半胱氨酸無味感,故對本實驗結(jié)果無影響。復合蛋白酶+木瓜蛋白酶組合(S7)的鮮味氨基酸含量是最多的,但與此同時,苦味氨基酸含量也很高,所以對整體味感的平衡有所破壞,同樣鮮味氨基酸也較高的復合風味蛋白酶+木瓜蛋白酶的組合也是苦味氨基酸含量高,對比發(fā)現(xiàn),復合蛋白酶+復合風味蛋白酶組合(S5)的鮮味氨基酸含量高,苦味氨基酸含量低,甜味氨基酸含量適中,制備出的香精味感圓潤、柔和,是最佳的組合酶。

表6 不同酶制備牛骨素熱反應(yīng)香精的氨基酸及TAV分析結(jié)果Table 6 The analysis of content of amino acids and TAV in thermal flavorings made by different kinds of enzymes

圖2 不同酶對牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中鮮味氨基酸含量的影響Fig.2 The influence of different enzymes on the content of umami-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

圖3 不同酶對牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中甜味氨基酸含量的影響Fig.3 The influence of different enzymes on the content of sweet-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

圖4 不同酶對牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中苦味氨基酸含量的影響Fig.4 The influence of different enzymes on the content of bitter-taste amino acids in bovine bone extract enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings

2.3.2 不同酶對核苷酸的影響 核苷酸含量對比如圖5所示,蛋白酶+風味蛋白酶組合(S5)中,不論是酶解液中,還是熱反應(yīng)香精中,其呈鮮味核苷酸含量均為最高,由表7中可以得到牛骨素中核苷酸含量并不豐富,僅0.136 g/L,經(jīng)過酶解后,各酶解液核苷酸含量均迅速增加,蛋白酶+風味蛋白酶組合(S5)核苷酸總量更是增加至0.530 g/L,約是未酶解骨素的4倍,其中S5香精中的核苷酸含量最高為15.69 g/L，這可能由于酶解過程破壞了牛骨素中的細胞,溶解出更多的核苷酸類物質(zhì),這些核苷酸可以作為美拉德反應(yīng)前體物,產(chǎn)生更多的揮發(fā)性肉香味化合物和不揮發(fā)性滋味物質(zhì)[33]。

圖5 不同酶對美拉德反應(yīng)香精與酶解液中核苷酸含量對比組合圖Fig.5 The comparison of the content of taste-active nucleotides in enzymatic hydrolysate and Maillard reaction flavorings made by different enzymes

2.3.3 不同酶對肽分布的影響 經(jīng)酶解后生成的肽作為香味形成的重要前體物,可以與還原糖、氨基酸、脂肪酸和硫胺素等風味前體物發(fā)生系列反應(yīng),不僅能產(chǎn)生特征香味,而且比起其他前體物參與的美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的揮發(fā)性芳香物質(zhì)更為豐富[34]。王然等[35]對谷胱甘肽-木糖美拉德反應(yīng)體系形成肉類風味的形成機制進行了研究,結(jié)果表明谷胱甘肽在肉香味化合物產(chǎn)生過程中起了很大的作用。Lancker等[36]模擬了以賴氨酸的-NH2為N端的二肽與葡萄糖、甲基乙二醛和乙二醛發(fā)生的美拉德反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)生了吡嗪類的混合芳香物質(zhì),而且與游離氨基酸參與的美拉德反應(yīng)相比,此二肽反應(yīng)產(chǎn)生的吡嗪等香味物質(zhì)更濃。文獻中提到,呈現(xiàn)鮮味和濃厚感的肽,大多在200～1000 Da[37-41],故本實驗以<1000 Da肽分布作為指標,以探索酶種類對肉味香精豐滿的口感的影響,結(jié)果見圖6。結(jié)果表明,酶解液中復合蛋白酶+木瓜蛋白酶(S7)酶解效果最差,其<1000 Da肽分布最低,僅10.15%;復合蛋白酶+復合風味蛋白酶(S5)效果最佳,達到33.73%。這些肽可以參與到Maillard反應(yīng)中,并且生成特征氣味物質(zhì),增加肉味香精的感官品質(zhì)。在香精中,<1000 Da肽分布最多的仍然為復合蛋白酶+復合風味蛋白酶(S5)組合,達到38.52%,制備的牛肉香精會由于小分子肽類的存在而增加鮮味和濃厚感。綜上,復合蛋白酶+復合風味蛋白酶組合(S5)亦是獲得呈味肽類的最佳組合酶。

圖6 不同酶對牛骨素酶解液與美拉德反應(yīng)香精中<1000 Da肽分布的影響Fig.6 The influence of different enzymes on <1000 Da peptide distribution in enzymatic hydrolysate of bovine bone extract and Marillard reaction flavorings

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果顯示,復合蛋白酶與復合風味蛋白酶組合酶解牛骨素效果最佳,其制備香精感官評價得分最高,香精牛肉香氣突出,圓潤柔和。揮發(fā)性氣味化合物方面,典型肉味香精風味物質(zhì)達68.27 ng/g。滋味化合物中,鮮味氨基酸含量高達0.99 g/L,鮮味氨基酸含量在10種香精中排名第二,且苦味氨基酸含量低,味感平衡。復合蛋白酶和復合風味蛋白酶組合制備的香精核苷酸含量最高,達到15.69 g/L;<1000 Da肽分布占比38.52%。整體肉香濃郁、持久,口感圓潤柔和,綜合各項指標,確定復合蛋白酶與復合風味蛋白酶為酶解牛骨素制備熱反應(yīng)香精的最佳組合酶。