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(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052; 2.新疆輕工職業(yè)技術學院,新疆烏魯木齊 830021; 3.新疆鄉(xiāng)都酒業(yè)有限公司,新疆烏魯木齊 841100)

葡萄皮渣是葡萄榨汁和釀酒加工過程中產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物,占葡萄加工量的25%～30%,其中主要含有葡萄皮、果梗、種子等[1-2]。葡萄籽在副產(chǎn)物中所占比例較大,高達90%;葡萄籽中蛋白質(zhì)含量較高,經(jīng)榨油后的餅粕中仍含有13～16%的蛋白質(zhì)[3];另外,葡萄籽中的總膳食纖維(Total dietary fiber,簡稱TDF)占總質(zhì)量的75%,可溶性膳食纖維(SDF)含量占TDF的15%[4]。除蛋白質(zhì)與膳食纖維外,還含有17種氨基酸,其中包括人體所需的8種必需氨基酸,這與大豆中的氨基酸含量基本一致,且主要為纈氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸等,還有許多K、Ca、P等常微量元素[5]。

Ping H E等[6]用蛋白酶酶解葡萄籽中以結(jié)合狀態(tài)存在的蛋白質(zhì),使多肽游離出來,從而達到分離目的。Villanueva-Su等[7]對豆渣進行了一系列的酶提取,酶提取法使得可溶性膳食纖維的組分增加,并且提高了可溶與不溶纖維的比例。Aurora等[8]用木霉酶處理小麥和大麥,使得提取的總DF 的量基本沒有變化,而可溶性膳食纖維的量提高了3倍。

以往的研究大多集中于用酶法對蛋白質(zhì)和膳食纖維進行分步提取,而在蛋白質(zhì)和膳食纖維的同步提取、富集方面鮮有相關報道。因此,以葡萄籽餅粕為原料,利用復合酶法對其中的蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維進行同步提取,通過對料液比、pH、溫度和時間等因素進行單因素及響應面試驗并優(yōu)化提取條件,以期達到對葡萄籽餅粕中蛋白質(zhì)和膳食纖維的同步提取和富集的目的,為葡萄籽餅粕的合理開發(fā)以及釀酒副產(chǎn)物中有效營養(yǎng)成分的提取提供理論依據(jù)和有利支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽粕 新疆鄉(xiāng)都葡萄酒有限公司;1 mol/L NaOH溶液,木瓜蛋白酶(活力≥800000 U/g)、纖維素酶(活力≥100000 U/g) 上海源葉生物有限公司。

FW-100高速萬能粉碎器 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;篩子(40目) 浙江省上虞市道墟紗篩廠;RE-85C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠;JB/T5374-1991 電子天平 海特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DZKW-S-6 電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;MYP11-2磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;普通型移液器(10、200、1000 μL) 上海榮泰生化工程有限公司;PHS-300 pH計 江蘇盛奧華環(huán)?？萍加邢薰?TDL-5-A低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂葡萄籽粕粉末的制備 葡萄籽粕用萬能粉碎機粉碎并過40目篩,把過篩的粉放在燒杯中,在常溫下倒入正己烷用玻璃棒不停攪拌,反復提取直至沒有油脂析出,15 min、4500 r/min離心之后將濾液合并,在真空度0.8 MPa、溫度65 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行正己烷的回收,回收得到的沉淀物在40 ℃的鼓風干燥箱內(nèi)干燥,最后制得脫脂葡萄籽粕粉末[9-10]。

1.2.2 葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維的提取 準確稱取脫脂葡萄籽粕,加蒸餾水調(diào)勻,用NaOH調(diào)節(jié)至所需pH，并加入木瓜蛋白酶和纖維素酶,充分反應后90 ℃水浴滅酶,離心10 min,收集上清液在參數(shù)為:進口溫度160 ℃、進料速率400 mL/h情況下進行噴霧干燥,即得蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維混合粉[11-13],并對蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維的含量進行測定。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 木瓜蛋白酶和纖維素酶之比對提取的影響 在加酶量為2%、料液比為1∶20 g/mL、浸提溫度50 ℃、浸提時間60 min、浸提液pH6.0,復合酶之比設定為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4,在上述條件下探討不同復合酶之比對葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取的影響,從而確定最佳的復合酶比例。

1.2.3.2 料液比對提取的影響 在加酶量為2%、復合酶之比為3∶1、浸提溫度50 ℃、浸提時間60 min和浸提液pH6.0,料液比設定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL,在上述條件下探討不同料液比對葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取的影響,從而確定最佳料液比。

1.2.3.3 pH對提取的影響 在加酶量為2%、復合酶之比為3∶1、料液比為1∶20 g/mL、浸提溫度50 ℃和浸提時間60 min,浸提液pH設定為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,在上述條件下探討不同浸提pH對葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取的影響,從而確定最佳的pH。

1.2.3.4 浸提時間對提取的影響 在加酶量為2%、復合酶之比為3∶1、料液比為1∶20 g/mL、浸提溫度50 ℃和浸提液pH6.0,浸提時間設定為30、40、50、60、70 min,在上述條件下探討不同浸提溫度對葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取的影響,從而確定最佳的浸提時間。

1.2.3.5 浸提溫度對提取的影響 在加酶量為2%、復合酶之比為3∶1、料液比為1∶20 g/mL、浸提時間60 min和浸提液pH6.0,浸提溫度設定為40、45、50、55和60 ℃,在上述條件下探討不同浸提溫度對葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取的影響,從而確定最佳的浸提溫度。

1.2.4 響應面試驗 響應面實驗設計因素水平表如表1所示。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factor and levels tabe of response surface assay

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測定 測定葡萄籽粉中蛋白質(zhì)運用凱氏定氮法和考馬斯亮藍G-250[14]。

蛋白質(zhì)提取率(%)=(提取液中蛋白質(zhì)的含量/葡萄籽中蛋白質(zhì)的含量)×100

式(1)

式中:提取液中蛋白質(zhì)的含量采用考馬斯亮藍法測定,葡萄籽中總蛋白的含量采用凱氏定氮法測定。

1.2.6 可溶性膳食纖維得率的計算 參照國家標準:GB 5009.88-2014[15]進行測定。

可溶性膳食纖維得率(%)=(可溶性膳食纖維的質(zhì)量/原料總質(zhì)量)×100

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Minitab 16.0對本次試驗的數(shù)據(jù)進行處理,運用Excel 2003和Design Expert 8.0.6中Box-Behnken進行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標準曲線的建立

如圖1所示得到線性回歸方程:Y=0.0075X+0.02517,決定系數(shù)R2=0.9968,說明牛血清白蛋白在濃度0～100 μg/mL,線性關系良好。

圖1 蛋白質(zhì)提取液測定標準曲線Fig.1 Protein extract determination standard curve

2.2 單因素實驗

2.2.1 木瓜蛋白酶與纖維素酶之比對蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取效果的影響 由圖2得出,在木瓜蛋白酶和纖維素酶的比例由4∶1增加為3∶1時，蛋白質(zhì)的提取率顯著性增加(p<0.05),3∶1時蛋白質(zhì)提取率達到最大值。隨著復合酶配比中木瓜蛋白酶的逐漸減少和纖維素酶的逐漸增加,蛋白質(zhì)的提取率逐漸下降;在木瓜蛋白酶和纖維素酶的比例為2∶1時，相比4∶1時可溶性膳食纖維的得率顯著增加(p<0.05),2∶1時得率達到最大,但繼續(xù)改變木瓜蛋白酶和纖維素酶的比例時得率,并無顯著變化(p>0.05),而在1∶3時,可溶性膳食纖維的得率又有所增加,可能是在酶解過程中,隨著纖維素酶不斷增加，不溶性膳食纖維一部分轉(zhuǎn)變成可溶性膳食纖維,另一部分轉(zhuǎn)化為其他的物質(zhì)。通過可溶性膳食纖維得率的變化可知,當酶加入過量時,一些不溶性膳食纖維就會被分解成一些如多糖、單糖這類的小分子物質(zhì),在沉淀時小分子物質(zhì)不容易被沉淀,所以膳食纖維的提取率有所下降[16-17]。綜合分析選取3∶1為酶的最佳比。

圖2 木瓜蛋白酶與纖維素酶之比對提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of papain to cellulase on extraction rate

2.2.2 料液比對蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取效果的影響 由圖3可知,葡萄籽粕中蛋白質(zhì)提取率和可溶性膳食纖維得率隨著料液比升高而有所變化。在1∶10～1∶25 g/mL時,蛋白質(zhì)的提取率顯著增加(p<0.05),隨著料液比繼續(xù)增加,提取率并無顯著變化(p>0.05);在1∶10～1∶15 g/mL時可溶性膳食纖維的得率有顯著的增加(p<0.05),料液比為1∶15～1∶20時，可溶性膳食纖維得率繼續(xù)增加，但差異不顯著(p>0.05),料液比繼續(xù)增加時水溶性膳食纖維得率有明顯的下降趨勢。細胞內(nèi)外的滲透壓力發(fā)生變化,導致底物濃度過低分子間的擴散速度增加,分散不均勻,體系的粘度逐漸降低,局部酸堿度過高,酶的活性降低[18-19]。并且與實際生產(chǎn)相結(jié)合綜合因素考慮,選擇料液比以1∶20為佳。

圖3 料液比對提取率影響Fig.3 Effect of material to liquid ratio on extraction rate

2.2.3 pH對蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取效果的影響 由圖4可知,葡萄籽粕中蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維隨著pH的升高有著明顯的變化,在pH為4～6時,蛋白質(zhì)的提取率有顯著的增加(p<0.05),pH為7時提取率達到最大,當pH為7時,蛋白質(zhì)的提取率達到一定的較高值73.26%;而當pH為4～5,可溶性膳食纖維的得率有顯著性增加(p<0.05),pH為5時提取率達到最高值,之后隨著pH的增加,可溶性膳食纖維的得率呈下降的趨勢,因為一般情況下可溶性膳食纖維的提取都是在酸性條件下,如果酸性較弱，反應將不會進行或者進行非常慢,如果酸性比較強,反應較快不能有效控制，從而使得產(chǎn)品的提取率下降[20-21]。結(jié)合各因素考慮同步提取過程中pH應該選擇為6.0。

圖4 pH對提取率的影響Fig.4 Effect of pH value on extraction rate

2.2.4 提取時間對蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取效果的影響 由圖5得出,在反應最初的30～40 min時,蛋白質(zhì)的提取率顯著增加(p<0.05),40 min提取率達到最大,隨著時間的不斷延長,提取率反而下降;在30～60 min時,可溶性膳食纖維得率顯著增加(p<0.05),60 min提取率達到最大值,隨著時間的不斷延長,得率有明顯的下降,反應時間的增加使得果膠裂解的量增加,氫離子水解產(chǎn)量降低[22-23]。由此選擇50 min為最佳的酶解時間。

圖5 時間對提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction rate

2.2.5 提取溫度對蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維提取效果的影響 由圖6可以得出,葡萄籽粕中蛋白質(zhì)提取率和可溶性膳食纖維得率隨著溫度升高變化較為明顯,在40～45 ℃時蛋白質(zhì)的沒有顯著的變化(p>0.05),在50 ℃時提取率顯著增大到最大值(p<0.05),但是溫度繼續(xù)增加提取率有下降的趨勢;可溶性膳食纖維在40～45 ℃時沒有顯著的變化(p>0.05),在50 ℃時提取率達到最大(p<0.05),但是溫度繼續(xù)增加得率有下降的趨勢;分析原因溫度與酶的活力呈正相關,提取溫度的升高會使得分子空間結(jié)構(gòu)破壞的同時發(fā)生了一定的變化,所以使得提取率下降[24-25]。由此選擇50 ℃為最佳的酶解溫度。

2.3 酶法提取葡萄籽粕可溶性膳食纖維的響應面試驗

2.3.1 響應面實驗設計方案及結(jié)果

表2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果Table 2 Response surface optimization test results

2.3.2 蛋白質(zhì)提取率的響應面結(jié)果分析 由表3中的數(shù)據(jù)得出多元擬合回歸方程料液比(A)、pH(B)、溫度(C)和時間(D)如下:

表3 蛋白質(zhì)回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of protein regression equation

Y1=82.52+3.15A+1.35B+0.92C+0.26D-7.31AB-3.22AC-0.92AD-0.31BC-0.17BD+1.71CD-17.86A2-8.98B2-4.83C2-3.62D2

模型p<0.01,表明回歸模型極顯著,失擬項的p值為0.5853(p>0.05),說明失擬項不顯著,表明該模型擬合度良好。在此模型中A、AB、AC、BC、A2、B2、C2、D2都是顯著因子。模型決定系數(shù)R2=0.9672,調(diào)整決定系數(shù)R2=0.9344,說明葡萄籽粕蛋白質(zhì)的提取實驗值與預測值之間有較好的擬合度。

表4 可溶性膳食纖維回歸方程的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of regression equation of soluble dietary fiber

2.3.3 膳食纖維得率的響應面結(jié)果分析 由表3中的數(shù)據(jù)可以得出多元擬合回歸方程料液比(A)、pH(B)、溫度(C)和時間(D)如下:

Y2=33.05-0.21A-0.29B-0.17C-0.17D-2.00AB-1.38AC-0.25AD-1.37BC-0.25BD+1.00CD-10.44A2-5.31B2-3.00C2-3.00D2

模型p<0.0001,表明回歸模型極顯著,失擬項的p值為0.6858(p>0.05),說明失擬項不顯著,表明該模型擬合度良好。在此模型中AB、A2、B2影響極顯著(p<0.001),A、AC、BC、C2、D2影響高度顯著(p<0.01)。模型決定系數(shù)R2=0.9715,調(diào)整決定系數(shù)R2=0.9430,說明葡萄籽粕可溶性膳食纖維的提取實驗值與預測值之間有較好的擬合度。

通過響應面法對提取工藝進行優(yōu)化,以四因素三水平確定二次回歸方程,擬合單因素與葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維和提取率之間的函數(shù)關系,進行響應面的形狀擬合,所得到的蛋白質(zhì)的響應面圖為圖7,葡萄籽粕蛋白質(zhì)料液比、酶解溫度、酶解時間、pH的變化呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,等高線較為密集狀態(tài),均在試驗測定范圍之內(nèi)。

圖7 蛋白質(zhì)的各因素與提取率的響應面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of various factors and extraction rates of protein

可溶性膳食纖維的響應面圖為圖8?？扇苄陨攀忱w維得率隨著物料與水之比、酶解溫度、酶解時間、pH的變化呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,等高線較為密集狀態(tài),均在試驗測定范圍之內(nèi)。綜上所述,蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維得率不是簡簡單單的線性關系,也不僅僅受溫度、時間、料液比和pH的影響,各個因素都在不同程度地影響著蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維的提取率，且各因素之間相互交錯。

圖8 膳食纖維各因素之間的響應面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour map between dietary fiber factors

2.3.4 提取工藝條件的優(yōu)化和可靠性驗證 通過單因素和響應面的29組實驗可以得出pH7.02、提取溫度50.21 ℃和提取時間50.66 min、料液比1∶20.37 g/mL的條件下葡萄籽粕蛋白質(zhì)的理論提取率為82.70%。pH6.99、提取溫度49.74 ℃、提取時間44.84 min和料液比1∶19.97 g/mL的條件下葡萄籽粕可溶性膳食纖維的理論得率為33.51%。綜合因素考慮到可操作性,將最優(yōu)條件定為:提取溫度50 ℃、pH7.0、料液比為1∶20 g/mL,提取時間50 min,此時得到葡萄籽粕蛋白質(zhì)提取率可達83.07%±1.43%,可溶性膳食纖維的得率為34.04%±0.87%。與理論值較為接近,由此得出對優(yōu)化葡萄籽粕蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維的酶法提取工藝建立的數(shù)學模型是可行的。

3 結(jié)論

本實驗通過單因素實驗對葡萄籽粕蛋白質(zhì)提取率和可溶性膳食纖維得率進行了分析,根據(jù)溫度、時間、料液比、pH對實驗的單因素控制,經(jīng)響應面實驗優(yōu)化同一工藝同步提取的最佳的工藝參數(shù)為提取溫度50 ℃、料液比1∶20 g/mL、提取時間50 min、pH7.0、蛋白質(zhì)提取率可達83.07%±1.43%,可溶性膳食纖維得率可達34.04%±0.87%。說明響應面法建立的數(shù)學模型對葡萄籽粕中蛋白質(zhì)和可溶性膳食纖維同步提取具有穩(wěn)定可靠性。