心衰時β腎上腺素能受體(βAR)信號的丟失與心肌G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(GRK2)的表達(dá)和活性增高有關(guān),是心衰最重要的病理生理機(jī)制之一。抑制GRK2的表達(dá)可糾正異常的βAR信號系統(tǒng),從而改善心衰病人的心肌收縮功能。研究表明，β受體阻滯劑能抑制心衰病人GRK2的表達(dá),改善β受體信號系統(tǒng),進(jìn)而改善心肌收縮功能和心肌重塑[1]。流行病學(xué)證實,缺血性心臟病是導(dǎo)致心衰的主要原因,其中急性心肌梗死演變?yōu)樾乃サ目赡苄愿?。已有臨床觀察發(fā)現(xiàn)，老年急性ST段抬高型心肌梗死病人GRK2水平與其預(yù)后相關(guān)[2],應(yīng)用β阻滯劑病人GRK2水平低于未應(yīng)用者且預(yù)后較好[3]。而在老年人群中,急性非ST段抬高型心肌梗死的發(fā)病率和死亡率更高。本文旨在探討美托洛爾對老年急性非ST段抬高型心肌梗死病人外周血淋巴細(xì)胞 GRK2 表達(dá)的影響,為阻止或延緩心肌梗死演變?yōu)樾牧λソ摺⒅笇?dǎo)急性心肌梗死的治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象與分組 新入院、經(jīng)風(fēng)險評估后選擇藥物治療的65歲以上老年男性急性非ST段抬高型心肌梗死病人80例,依據(jù)是否適宜應(yīng)用美托洛爾分為對照組和美托洛爾治療組,每組各40例,登記其臨床資料。2組病人入院后均予以抗血小板、抗凝、調(diào)脂、抗心肌缺血等常規(guī)治療。美托洛爾組經(jīng)常規(guī)治療病情穩(wěn)定后,在對照組用藥基礎(chǔ)上加用美托洛爾6.25 mg,2次/d,持續(xù)應(yīng)用2周后,無明顯不良反應(yīng)者加量為12.5 mg,2次/d。分別于發(fā)病24 h內(nèi)和治療3、6、12、24個月時行心臟超聲檢查,并分別抽取外周血檢測淋巴細(xì)胞GRK2的表達(dá)情況。

1.2 方法

1.2.1 心臟功能檢測:發(fā)病24 h內(nèi)和治療3、6、12、24個月時行心臟超聲心動圖檢查,檢測其左心室收縮期和舒張期的各項參數(shù),包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)。

1.2.2 主要試劑:人淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、RIzol 及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)、GRK2抗體(Cell Signaling Technology)。

1.2.3 外周血淋巴細(xì)胞分離:發(fā)病24 h內(nèi)和治療3、6、12、24個月時采集靜脈血,每份2 mL,EDTA 抗凝。將人抗凝靜脈血以PBS稀釋并混勻,再加至裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,使三者體積比為1∶1∶1;混合液離心(2000 r/min,30 min)分層,小心吸出中間淋巴細(xì)胞層,以PBS離心洗滌2次,并計數(shù)。

1.2.4 qRT-PCR技術(shù)檢測GRK2 mRNA的表達(dá):將分離出的淋巴細(xì)胞,按照Trizol說明書提取RNA,合成cDNA;qRT-PCR的反應(yīng)條件:共38個循環(huán),以β-actin 為內(nèi)參,2-Ct法計算mRNA的相對表達(dá)水平。人β-actin 引物:上游5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′,下游5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′;人GRK2 引物:上游5′-GAA CAC ATG CAC AAT CG-3′,下游5′-CCA GGG AGA ACC AGT C-3′。上述引物均由北京賽百勝公司合成。

1.2.5 Western blot檢測GRK2蛋白表達(dá):提取分離出的淋巴細(xì)胞蛋白,采用BCA法測定蛋白的濃度,調(diào)整蛋白濃度后取40μg總蛋白,經(jīng)SDS-PAGE后,電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜,用TBST配置的5%BSA封閉3 h,按1∶500比例加入蛋白一抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2000),室溫孵育1 h。洗滌3次,ECL法顯影,ImageQuant_LAS500一體化成像儀成像。Image-J軟件對蛋白印跡進(jìn)行積分吸光度分析,蛋白表達(dá)水平用IAGRK2/IAβ-actin比值表示。

2 結(jié)果

2.1 2組基線資料比較 治療前2組間病人的年齡、身高、體質(zhì)量、入院時的心率、收縮壓、LVEF以及LVIDd差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.2 2組治療前后心臟超聲指標(biāo)比較 隨著治療時間的延長,與基線相比,對照組各隨訪時間點的LVEF水平增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而美托洛爾組的增高趨勢更加明顯:3個月后,美托洛爾組的LVEF值顯著高于同期對照組(P<0.05);12個月后LVEF值顯著高于基線值(P<0.05)。同時,2組各隨訪點LVIDd水平與基線相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;24個月時,美托洛爾組的LVIDd水平顯著低于同期對照組(P<0.05)。

表1 2組病人基線資料比較

表2 對照組和美托洛爾組治療前后超聲指標(biāo)比較

注:與基線比較,*P<0.05;與對照組比較,△P<0.05

2.3 治療前后外周血淋巴細(xì)胞GRK2 mRNA的表達(dá) 隨著治療時間的延長,對照組GRK2 mRNA水平逐漸增高,而美托洛爾組GRK2 mRNA的表達(dá)則逐漸降低;美托洛爾治療6個月后,治療組GRK2 mRNA的表達(dá)顯著低于基線(P<0.05)及同期對照組水平(P<0.05),見圖1。

注：與基線比較,*P<0.05;與同期對照組比較,△P<0.05圖1 2組外周血淋巴細(xì)胞GRK2 mRNA 的表達(dá)情況

2.4 治療前后外周血淋巴細(xì)胞GRK2 蛋白的表達(dá) 采用Western blot檢測GRK2蛋白表達(dá),結(jié)果與GRK2 mRNA變化趨勢相似。隨著治療時間的延長,對照組GRK2 蛋白水平逐漸增高,在12個月時顯著高于基線(P<0.05),而美托洛爾組GRK2 蛋白的表達(dá)則逐漸降低;美托洛爾治療3個月后,GRK2蛋白表達(dá)顯著低于基線(P<0.05);6個月后,美托洛爾組GRK2蛋白表達(dá)顯著低于同期對照組(P<0.05),見圖2。

A:Western blot檢測GRK2蛋白表達(dá);B: GRK2蛋白相對表達(dá)量比較, 注：與基線時比較,*P<0.05;與對照組比較,△P<0.05圖2 2組外周血淋巴細(xì)胞GRK2蛋白的表達(dá)情況

3 討論

G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)是一種絲/蘇氨酸激酶,可磷酸化激活G蛋白耦合受體胞內(nèi)域,導(dǎo)致胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)信號衰減。在7種GRKs中,GRK2因其在心臟的高表達(dá)而對心臟功能具有重要意義。心肌梗死后心肌GRK2表達(dá)和活性增強,對心臟βAR有顯著的有害作用,可導(dǎo)致βAR脫敏或下調(diào)βAR基因的表達(dá)[4]。多項研究證實,在急性心肌梗死病人心功能惡化時，淋巴細(xì)胞GRK2水平增加[3,5-6]。White等[7]在冠脈結(jié)扎心肌梗死兔模型中通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)β-Arkct后降低了GRK2的表達(dá),20 d后該組動物的心功能顯著好于對照組。因此,淋巴細(xì)胞GRK2被認(rèn)為是治療心肌梗死的一個潛在靶標(biāo)。

美托洛爾是一種選擇性β1受體阻滯劑,臨床研究證實其在治療高血壓、心肌肥大、慢性心力衰竭等方面有重要的價值。我們前期的研究證實了老年急性ST段抬高型心肌梗死病人GRK2水平與其預(yù)后相關(guān),美托洛爾可降低淋巴細(xì)胞GRK2水平，從而一定程度減輕了心功能的丟失[3]。與ST段抬高型心肌梗死相比,急性非ST段抬高型心肌梗死在老年人群中的發(fā)病率及致死率更高;且再發(fā)率高,對后續(xù)心功能的影響更大,病人發(fā)展為心衰的概率更高。因此,明確美托洛爾在老年非ST段抬高型心肌梗死中對GRK2表達(dá)的影響具有重要意義。

本研究證實,老年急性非ST段抬高型心肌梗死病人在美托洛爾治療后,GRK2 mRNA和蛋白的表達(dá)逐漸降低;在治療6個月后,GRK2 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著低于基線和同期對照組。與此對應(yīng),因所有病人均應(yīng)用了心肌梗死標(biāo)準(zhǔn)治療,所以2組的LVEF均呈恢復(fù)趨勢;但美托洛爾組LVEF值的增高趨勢更加明顯,12個月后LVEF值顯著高于基線值;而對照組在隨訪結(jié)束時LVEF值與基線值相比仍無顯著改善。2組各隨訪點LVIDd值與基線相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;24個月時,美托洛爾組的LVIDd值顯著低于同期對照組。表明長期應(yīng)用美托洛爾治療不僅可以改善心功能,還可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)左室重塑。

美托洛爾在多種心臟疾病中具有重要作用,但到目前為止,其作用機(jī)制仍不完全明了。新近研究證實,除了對βAR的直接阻斷、阻止兒茶酚胺誘導(dǎo)的心肌毒性以外,美托洛爾尚可下調(diào)GRK2的表達(dá)和活性恢復(fù)，促進(jìn)一氧化碳(NO)的合成和釋放。Trappanese等[8]在犬二尖瓣反流心衰模型中證實,美托洛爾可促進(jìn)心臟β3AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑恢復(fù),通過提高nNOS活性進(jìn)一步恢復(fù)NO的保護(hù)效應(yīng)。因此,美托洛爾可能較其他β阻滯劑更適用于老年人群;這可能也是本研究中美托洛爾治療老年非ST段抬高型心肌梗死病人后能夠顯著改善心功能的重要機(jī)制。

盡管本研究證實在老年非ST段抬高型心肌梗死病人中應(yīng)用美托洛爾可抑制GRK2表達(dá)和活性,延緩甚至逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)、保留心功能;但臨床中,并非所有病人都適合應(yīng)用美托洛爾。本研究入選病人時,因低血壓、心動過緩不能應(yīng)用美托洛爾者為數(shù)不少,有3例在應(yīng)用后出現(xiàn)頭暈、乏力等不適癥狀而停用。因此,需要積極開發(fā)基于下調(diào)GRK2且適用于此類病人的新型藥物。