糖尿病的發(fā)病率已呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì),作為腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,有研究表明,糖尿病和(或)高血糖狀態(tài)會(huì)使腦缺血再灌注(I/R)損傷進(jìn)一步加重,但具體機(jī)制尚不明確[1]。缺血后處理(IP)作為一種新干預(yù)策略誘導(dǎo)缺血耐受,在腦缺血早期給予短暫的I/R處理,可明顯減輕腦組織損傷,具有重要的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)[2]。但是至今IP對(duì)腦I/R損傷的作用和機(jī)制,尤其是在合并糖尿病的腦I/R損傷中的具體機(jī)制仍未闡明。炎癥負(fù)性調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS-3)作為一種神經(jīng)保護(hù)標(biāo)志物,對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)等在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞因子起著負(fù)性調(diào)控作用,其在腦I/R損傷中的表達(dá)及作用機(jī)制是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[3]。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立糖尿病大鼠局灶性腦I/R模型,觀察IP對(duì)SOCS-3、TNF-α表達(dá)水平的影響,以進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:選用115只健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量160～180 g,由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將其隨機(jī)分為2組:糖尿病組(105只)及普通組(10只)。建立糖尿病模型后,將糖尿病大鼠隨機(jī)分為sham組、I/R組和IP組各35只,各組以腦缺血90 min再灌注后的不同時(shí)間點(diǎn)(3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h)分為6個(gè)亞組,除24 h組為10只(其中5只用于TTC染色測(cè)定腦梗死體積)外,其余每個(gè)亞組5只。(2)主要試劑:鏈脲佐菌素(STZ,美國(guó)Sigma公司);兔抗大鼠SOCS-3多克隆抗體、兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體(美國(guó) BIoworld公司);DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 研究方法 動(dòng)物模型制備:普通組予以普通飼料喂養(yǎng),糖尿病組參考林心君等[4]的高脂高糖配方飼料予以喂養(yǎng)4周,進(jìn)行2次STZ腹腔注射[25 mg/(kg·m2),間隔2 d],制備糖尿大鼠病模型。經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,成功后將其仰臥固定于解剖架上,充分并暴露頸部組織。I/R組依照改良Longa[5]法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈I/R模型,缺血90 min后輕拔出栓線實(shí)施再灌注;IP組采用孫靜等[6]的方法,于缺血90 min后拔出栓線5 mm,進(jìn)行灌注15 s/閉塞15 s,重復(fù)3次后拔出拴線實(shí)現(xiàn)永久灌注。sham組僅暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及分叉處,不行線栓,其余步驟同手術(shù)組。大鼠造模清醒后根據(jù)Longa[5]的評(píng)分原則評(píng)價(jià)造模是否成功,不符合標(biāo)準(zhǔn)的予以剔除，再后續(xù)補(bǔ)足。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分:在缺血再灌注術(shù)后各時(shí)間點(diǎn),依據(jù)Garcia[7]原則對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分,18分為最高分,3分為最低分,得分越低則神經(jīng)功能障礙越重。

1.3.2 TTC染色測(cè)定術(shù)后24 h腦梗死體積:選取各組術(shù)后24 h大鼠(5只)予以麻醉處死,立即斷頭取腦,并去除低位腦干及小腦,冠狀切片約(2 mm)行TTC避光染色,正常腦組織為紅色,梗死腦組織為蒼白色。對(duì)各切片拍照后用Image Pro Plus 5.1圖像分析處理圖片,以公式V=(A1+…+An)t/2測(cè)定腦梗死體積,其中t為切片厚度(mm),A為梗死體積(mm3)。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織SOCS-3、TNF-α的表達(dá):各組大鼠分別于造模后不同時(shí)間(3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h)予以麻醉處死,立即斷頭取腦,并去除低位腦干及小腦。將所取新鮮腦組織于4%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋,切片(厚3μm),置于載玻片上,4 ℃保存。將備用切片參照試劑盒具體說(shuō)明進(jìn)行操作,于400倍高倍鏡下觀察,胞質(zhì)、胞核呈棕黃色為SOCS-3、TNF-α表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞,分別選取5個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均值。

1.3.4 TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞表達(dá):將備用切片參照TUNEL染色試劑盒具體說(shuō)明進(jìn)行操作,于400倍高倍鏡下觀察,胞核呈棕色為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞,分別選取5個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均值。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型 參考林心君等[4]的糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn):隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L和(或)2次禁食血糖(FBG)≥11.1 mmol/L,測(cè)大鼠尾靜脈血糖濃度,糖尿病組比普通組大鼠顯著增高(P<0.05),表明糖尿病大鼠造模成功。

2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 sham組無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀,I/R組和IP組再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分均低于sham組(P<0.05),與I/R組比較,IP組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分顯著增高(P<0.05),且2組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均在24 h時(shí)最低。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較分，n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

2.3 術(shù)后24 h腦梗死體積 根據(jù)TTC染色結(jié)果,sham組中未見(jiàn)梗死灶,I/R和IP組均可見(jiàn)蒼白色梗死灶,且IP組梗死灶體積較I/R組顯著減小[(163.60±12.10) mm3比(198.20±9.73) mm3,P<0.05]。

2.4 各組大鼠腦組織SOCS-3和TNF-α的表達(dá) 根據(jù)免疫組化檢測(cè)結(jié)果,SOCS-3和TNF-α在sham組中可見(jiàn)微量表達(dá),但無(wú)動(dòng)態(tài)變化,其在I/R組中的表達(dá)于3 h開(kāi)始升高,24 h達(dá)高峰,之后逐漸下降,在72 h仍有少量表達(dá),IP組表達(dá)趨勢(shì)與I/R組相同,但I(xiàn)P組中各時(shí)間點(diǎn)SOCS-3表達(dá)較I/R組明顯升高(P<0.05)，TNF-α表達(dá)較I/R組明顯降低(P<0.05),且I/R和IP組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于sham組(P<0.05)。見(jiàn)表2,3。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織SOCS-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較個(gè)/視野,n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較個(gè)/視野,n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

2.5 各組大鼠凋亡細(xì)胞表達(dá) 根據(jù)TUNEL法檢測(cè)結(jié)果,sham組僅見(jiàn)極少的凋亡細(xì)胞,I/R組中凋亡細(xì)胞于3 h開(kāi)始升高,24 h達(dá)高峰,之后逐漸下降;IP組中表達(dá)趨勢(shì)與I/R組相似,但I(xiàn)P組各時(shí)間點(diǎn)較I/R組表達(dá)明顯減少(P<0.05);且I/R和IP組中各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞表達(dá)均較sham組顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較個(gè)/視野,n=5)

注:與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,△P<0.05

3 討論

糖尿病是一組由遺傳及環(huán)境等多因素引起的,以高血糖為特征的代謝性疾病。作為臨床多發(fā)病、常見(jiàn)病,糖尿病與腦缺血損傷密切相關(guān),臨床研究證實(shí),糖尿病不但能誘發(fā)腦缺血,而且會(huì)使腦缺血損傷進(jìn)一步加重,糖尿病合并腦缺血病人預(yù)后更差[8], 故本實(shí)驗(yàn)以糖尿病大鼠為基礎(chǔ)建立腦I/R模型更符合腦缺血的自然發(fā)病進(jìn)程。恢復(fù)血流是腦缺血的治療原則,但血流恢復(fù)后會(huì)造成不可避免的I/R損傷。Zhao等[9]研究結(jié)果顯示, 在腦I/R時(shí)行IP,腦梗死體積及神經(jīng)元凋亡顯著減少,可實(shí)現(xiàn)缺血保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)參考孫靜等[6]的腦I/R模型,反復(fù)3次的再灌注15 s/缺血15 s為IP發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的最佳時(shí)間,經(jīng)反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn),這種IP措施能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

腦I/R損傷是多機(jī)制參與的病理生理過(guò)程,包含炎癥反應(yīng)、自由基生成、細(xì)胞凋亡等,其中炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)起著重要的作用。TNF-α是一種前炎性反應(yīng)因子,具有細(xì)胞毒性和促炎性作用,是腦缺血損傷轉(zhuǎn)向炎癥損傷的核心基礎(chǔ)。在腦I/R時(shí)，炎癥反應(yīng)被激活,TNF-α等大量炎性細(xì)胞因子釋放,激發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放舒縮血管活性物質(zhì),破壞血腦屏障,造成神經(jīng)元損傷,同時(shí)還可啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步加重I/R損傷,故抑制炎性因子的表達(dá)對(duì)減輕腦I/R損傷有重要意義。SOCS-3作為一種內(nèi)源性抑制因子,通過(guò)抑制JAK/STAT途徑,對(duì)TNF-α等大量炎性因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)性調(diào)控,可達(dá)到抑制炎性因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡的作用。

Bate等[10]的研究發(fā)現(xiàn),在腦缺血側(cè)腦組織呈現(xiàn)SOCS-3 mRNA高表達(dá),并在12 h達(dá)高峰,在24 h仍有一定表達(dá)。Raghavendra等[11]的研究發(fā)現(xiàn),若反義減少SOCS-3的表達(dá),梗死體積明顯增高,神經(jīng)功能缺損加重。而予以腺病毒載體過(guò)度的SOCS3表達(dá)后,梗死體積明顯縮小[12]。故認(rèn)為SOCS-3在I/R損傷中起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究基本相同,發(fā)現(xiàn)I/R后SOCS-3表達(dá)增高,IP能上調(diào)其表達(dá)。Yin等[13]研究發(fā)現(xiàn),缺血側(cè)腦組織TNF-αmRNA在24 h出現(xiàn)高峰,隨后逐漸下降。He等[14]研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腦I/R后3 h,TNF-α開(kāi)始表達(dá)并在24 h達(dá)高峰,減少其表達(dá)或抑制其活性可減輕腦損傷,提示TNF-α可能與腦I/R損傷有關(guān)。且在此之前有學(xué)者在腦I/R模型中用TNF-α抗體中和TNF-α后,大鼠神經(jīng)功能缺損有明顯改善[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，I/R后TNF-α表達(dá)增高,IP能減少其表達(dá),與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符,而且TNF-α與SOCS-3變化趨勢(shì)相同,說(shuō)明腦IP可通過(guò)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制上調(diào)SOCS-3表達(dá),減少TNF-α表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)。同時(shí)TUNEL法測(cè)得凋亡細(xì)胞結(jié)果顯示,I/R 組在3 h 可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞的表達(dá),隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞表達(dá)增多,于24 h 達(dá)到高峰,IP組凋亡細(xì)胞的表達(dá)明顯減少,結(jié)合上述 TNF-α的表達(dá)可發(fā)現(xiàn),凋亡細(xì)胞表達(dá)趨勢(shì)與 TNF-α趨于一致,且24 h梗死體積測(cè)定結(jié)果顯示,IP組梗死體積較I/R組明顯縮小,說(shuō)明在I/R后TNF-α等炎性因子表達(dá)增加,可通過(guò)激活JAK/STAT通路,引起組織損傷及細(xì)胞凋亡,同時(shí)I/R損傷本身也增加SOCS-3表達(dá),抑制炎癥反應(yīng),IP通過(guò)增加SOCS-3表達(dá),負(fù)性調(diào)節(jié)JAK/STAT通路,減少TNF-α過(guò)量表達(dá),從而抑制腦組織炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,縮小梗死體積,達(dá)到腦保護(hù)作用。

綜上所述,TNF-α在腦I/R中起重要作用,IP可通過(guò)增加SOCS-3表達(dá)抑制TNF-α表達(dá),從而激發(fā)內(nèi)源性腦保護(hù),減輕腦I/R損傷。但由于本實(shí)驗(yàn)采用糖尿病大鼠制作腦I/R模型,與既往相似研究相比炎性因子表達(dá)較高。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病會(huì)使腦內(nèi)毒性物質(zhì)蓄積、腦I/R損傷中重要蛋白表達(dá)改變以及內(nèi)源性保護(hù)性物質(zhì)生成減少,可使腦組織在誘發(fā)缺血耐受時(shí),達(dá)不到產(chǎn)生缺血耐受的閾值而弱化腦IP保護(hù)作用[16-17],但具體機(jī)制尚不清楚,還有待進(jìn)一步研究。