周曉麗 孫毅娜 錢智勇 顧清 張倩 李晶

1天津市疾病預(yù)防控制中心毒理科 300011； 2國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津醫(yī)科大學(xué))，天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 300070; 3天津市疾病預(yù)防控制中心傳染病科 300011

隨著生活水平的提高，患有高脂血癥的人數(shù)不斷增加且呈年輕化趨勢(shì)。研究表明，高脂血癥是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化及心、腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[1]。因此，對(duì)高脂血癥的預(yù)防對(duì)控制心、腦血管疾病的發(fā)生有重大意義。研究表明，飲食干預(yù)對(duì)于控制高脂血癥的發(fā)展有重要作用[2]。硒是人體必需的元素之一，參與人體許多生理活動(dòng)，如甲狀腺激素的代謝、DNA的合成、保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷、防止感染等，適量補(bǔ)硒有一定的防癌、抗氧化作用。富硒酵母是一種生物硒，是在培養(yǎng)酵母的過(guò)程中加入硒元素，酵母生長(zhǎng)時(shí)吸收、利用了硒，使硒與酵母體內(nèi)的蛋白質(zhì)和多糖有機(jī)結(jié)合轉(zhuǎn)化為生物硒，從而消除了化學(xué)硒(如亞硒酸鈉)對(duì)人體的毒性作用和腸胃刺激，使硒能夠更高效、更安全地被人體吸收利用，此外富硒酵母還可以降低血低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、總膽固醇和甘油三酯水平。維生素B6可以提高大鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的作用，從而保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷，能降低血LDL-C水平，在脂代謝中起重要作用。本研究旨在評(píng)價(jià)其在特定人群中食用的安全性和有效性，為硒聯(lián)合維生素B6的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)資料，并為通過(guò)合理飲食有效防治高脂血癥提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為2017年6-12月在天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院體檢的本院職工及天津市老年大學(xué)學(xué)員中首次檢出高脂血癥者，其中符合標(biāo)準(zhǔn)并自愿參與試驗(yàn)且簽署知情同意書者共100例，根據(jù)血脂水平區(qū)組隨機(jī)方法，將受試者分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組50例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：在正常飲食情況下，檢測(cè)禁食12～14 h后的血脂水平，半年內(nèi)至少有兩次血脂檢測(cè)，血清甘油三酯水平≥1.7 mmol/L，或血清總膽固醇水平≥5.6 mmol/L；或者是血清高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平≤0.9 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18歲以下或65歲以上者；妊娠或哺乳期婦女；對(duì)保健食品過(guò)敏者；合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；精神病患者；短期內(nèi)正在使用降脂藥物及影響脂代謝藥物，影響到對(duì)結(jié)果的判斷者。

1.2 研究方法

1.2.1 干預(yù)方法 受試者干預(yù)前進(jìn)行體格檢查，以此作為干預(yù)效果評(píng)價(jià)的基準(zhǔn)，試驗(yàn)組按推薦服用方法，服用富硒酵母維生素E和維生素B6，每日各1次；對(duì)照組則服用相同外觀的安慰劑普通酵母維生素E，試驗(yàn)期間各組不服用其他降脂藥物，維持原生活、飲食不變。干預(yù)30 d后受試者進(jìn)行體檢，留取空腹抗凝全血、促凝血清，放置-80℃低溫保存。

1.2.2 主要試劑 富硒酵母維生素E，0.25 g/粒，含硒量為50 μg/粒，生產(chǎn)批號(hào)為20170701，普通酵母維生素E，0.25 g/粒，生產(chǎn)批號(hào)為20170702，均由安琪酵母股份有限公司提供。維生素B6含量為10 mg/粒，生產(chǎn)批號(hào)為1703005，購(gòu)于天津力生制藥股份有限公司。

測(cè)定血清總膽固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C的試劑均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐的試劑購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司。血常規(guī)檢測(cè)試劑包購(gòu)自日本Sysmex公司。硒單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)SUPELCO。人血清卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(LCAT)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、總脂酶試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。全血總RNA提取試劑盒購(gòu)自ZYMO Research公司，SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自TaKaRa公司。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)、過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體α(PPARα)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)引物由美國(guó)Thermo Fisher公司合成。

1.2.3 血清硒與維生素B6水平的測(cè)定 試驗(yàn)第0天、第30天分別用原子熒光光譜法和高效液相色譜法檢測(cè)受試者血清硒、血清維生素B6水平。

1.2.4 一般狀況的觀察以及血常規(guī)、血生化等指標(biāo)的測(cè)量 試驗(yàn)第0天和第30天，于天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院體檢中心對(duì)受試者進(jìn)行身體一般狀況的觀察，包括精神、睡眠、飲食、血壓，并行血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)以及胸透、心電圖的檢查。試驗(yàn)第0天和第30天，收集受試者空腹抗凝全血與血清，用五分類血液分析系統(tǒng)對(duì)受試者血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)，包括血清總蛋白、白蛋白、ALT、AST、肌酐、尿素氮水平。

1.2.5 血清總膽固醇、甘油三酯、LDL-C和HDL-C水平的測(cè)定 用全自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定試驗(yàn)第0天、第30天空腹血清總膽固醇、甘油三酯、LDL-C和HDL-C水平。

1.2.6 脂代謝酶的測(cè)定 采用總脂酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)受試者血清脂蛋白脂肪酶(LPL)和肝脂酶活性。用ELISA試劑盒測(cè)定受試者HMGR和LCAT水平。上述試驗(yàn)操作方法詳見試劑盒說(shuō)明書。

1.2.7 熒光定量PCR檢測(cè)脂代謝相關(guān)因子mRNA的表達(dá) 試驗(yàn)第30天，按照試劑盒說(shuō)明書的操作方法，采用全血總RNA提取試劑盒提取受試者抗凝全血總RNA，然后將1 μg總RNA通過(guò)Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Q-PCR在LightCycler? 480 (Roche 公司) 設(shè)備中進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)置 3個(gè)重復(fù)，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參。25 μl Q-PCR 反應(yīng)體系:2×SYBR Green Master Mix 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，F(xiàn)orward primer 1 μl，Reverse primer 1 μl，cDNA 2.0 μl。Q-PCR特異產(chǎn)物通過(guò)溶解曲線分析，相對(duì)Ct值法即X=2-ΔΔCt測(cè)定相對(duì)基因表達(dá)變化。用于Q-PCR的引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物大小

注：SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子1；PPARα：過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體α；SREBP-1c：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶

2 結(jié)果

2.1 一般資料 試驗(yàn)中試驗(yàn)組和對(duì)照組分別有8人和2人因失訪、服用降脂藥物或血糖升高等原因提前終止試驗(yàn)，最終有效例數(shù)為90例，試驗(yàn)組和對(duì)照組人數(shù)分別為 42例和48例。試驗(yàn)組平均年齡為(55.6±10.7)歲，對(duì)照組為(57.7±8.9)歲(t=1.043，P=0.300)；試驗(yàn)組男、女比例為14 ∶28，對(duì)照組為10 ∶38，性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.790，P=0.234)。

2.2 富硒酵母與維生素B6聯(lián)合干預(yù)對(duì)高脂血癥人群常規(guī)體檢指標(biāo)的影響 由表2可以看出，試驗(yàn)第0天、第30天，試驗(yàn)組各項(xiàng)體檢指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.863、-0.151、0.612、-0.536、-1.236、-1.850、-1.611、1.610、-1.274、-0.746，P均>0.05；t=0.272、-0.434、1.091、-0.054、-0.158、-0.786、-1.893、-0.452、-0.251、-1.216，P均>0.05)；與第0天相比，對(duì)照組和試驗(yàn)組第30天血清白蛋白水平降低(t=5.942、6.162，P均<0.05)，但在人體正常生理值范圍，無(wú)生物學(xué)意義。其他各項(xiàng)體檢指標(biāo)均未見顯著改變(t=0.071、-0.443、1.658、-0.064、0.233、-0.599、-0.589、1.647、0.873，P均>0.05；t=0.788、-0.170、1.532、-1.018、-0.660、0.040、0.601、0.504、1.125，P均>0.05)。

2.3 富硒酵母與維生素B6聯(lián)合干預(yù)對(duì)高脂血癥人群血脂水平的影響 由表3可以看出，與第0天相比，對(duì)照組第30天血清總膽固醇、LDL-C水平升高(t=-2.487、-2.865，P均<0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)未見明顯改變(t=-0.597、0.412，P均>0.05)；試驗(yàn)組第30天血清總膽固醇、LDL-C水平降低(t=2.190、2.086，P均<0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)未見顯著變化(t=2.427、0.964，P均>0.05)。第0天，試驗(yàn)組與對(duì)照組各項(xiàng)血脂指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.155、-4.791、-2.933、-4.744，P均>0.05)；第30天，試驗(yàn)組受試者血清總膽固醇、LDL-C水平低于對(duì)照組(t=2.960、2.990，P均<0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)未見顯著改變(t=1.750、-1.019，P均>0.05)。

2.4 富硒酵母聯(lián)合維生素B6對(duì)高脂血癥人群脂代謝酶的影響 由表4可以看出，第30天，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組血清HMGR水平降低，肝脂酶、LPL和總脂酶水平升高(P均<0.05)，兩組血清LCAT水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 富硒酵母聯(lián)合維生素B6對(duì)高脂血癥人群脂代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組全血SIRT1、PPARα mRNA表達(dá)水平升高，SREBP-1c mRNA表達(dá)水平降低(P均<0.05)，見表5。

表2 富硒酵母與維生素B6聯(lián)合干預(yù)對(duì)受試者常規(guī)血生化指標(biāo)的影響

注：WBC：白細(xì)胞計(jì)數(shù)；RBC：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；ALT：谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與同組第0天相比，aP<0.05；1 mmHg=0.133 kPa

表3 富硒酵母與維生素B6聯(lián)合干預(yù)對(duì)高脂血癥人群血脂水平的影響

注：TC:總膽固醇；TG:甘油三酯；LDL-C:低密度脂蛋白-膽固醇；HDL-C:高密度脂蛋白-膽固醇；與第0天相比，aP<0.05；與對(duì)照組相比，bP<0.05

表4 富硒酵母聯(lián)合維生素B6對(duì)高脂血癥人群脂代謝酶的影響

注：LCAT: 卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶；HMGR:3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶； LPL：脂蛋白脂酶；與對(duì)照組相比，aP<0.05

表5 富硒酵母聯(lián)合維生素B6對(duì)脂代謝相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響

注：SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子1；PPARα：過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體α；SREBP-1c：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c

2.6 試驗(yàn)前、后受試者血清硒與維生素B6的變化情況 第0天，試驗(yàn)組血清硒水平、維生素B6水平與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.350、-0.023，P均>0.05)，第30天，試驗(yàn)組血清硒水平、維生素B6水平均高于對(duì)照組(t=-2.606、-2.710，P均<0.05)，同時(shí)，與第0天相比，試驗(yàn)組血清硒水平、維生素B6水平升高(t=-4.296、-3.690，P均<0.05)，而對(duì)照組均無(wú)變化(t=-1.768、0.831，P均>0.05)。

表6 高脂血癥人群干預(yù)前、后血清硒和維生素B6水平

注：與對(duì)照組第30天相比，aP<0.05；與同組第0天相比，bP<0.05

3 討論

我國(guó)高脂血癥人群患病率一直居高不下，高脂血癥已對(duì)人類健康構(gòu)成重要威脅。血脂異常和微量元素密切相關(guān)[3]。富硒酵母和維生素B6作為重要的膳食營(yíng)養(yǎng)素，較降脂藥物具有低不良反應(yīng)、易攝入、易推廣等優(yōu)點(diǎn)，具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究在人群干預(yù)試驗(yàn)中，硒的干預(yù)分別采用亞硒酸鈉和富硒酵母兩種不同載體，富硒酵母是市場(chǎng)上最為常見的補(bǔ)硒保健品，是臨床試驗(yàn)中最常用的補(bǔ)硒物品，較亞硒酸鈉更為安全、不良反應(yīng)低并易于吸收[4-5]。采用普通酵母片作為對(duì)照能消除酵母的干擾，因此更加適用于人群干預(yù)試驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組在連續(xù)服用富硒酵母(硒含量50 μg/d)與維生素B6(10 mg/d)30 d后，身體一般狀況與對(duì)照組比較未見明顯差異，血常規(guī)、血生化及一般生理指標(biāo)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，表明連續(xù)服用上述劑量富硒酵母和維生素B6對(duì)人體無(wú)明顯不良影響。

人群試驗(yàn)表明，血硒水平與高脂血癥存在聯(lián)系，血清硒水平與HDL-C水平呈正相關(guān)[6]?？偰懝檀蓟騆DL-C水平升高是冠心病和缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，對(duì)血脂異常的防治必須及早給予重視[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，硒能降低大鼠血清總膽固醇和甘油三酯水平[8]。1971年Rotruck證實(shí)硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的組成物質(zhì)和維持酶活性的重要組成成分。硒既能通過(guò)降低GSH-Px活性分解過(guò)氧化物，又能增強(qiáng)維生素E的抗氧化能力，從而阻止過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞膜、線粒體及溶酶體膜上的脂質(zhì)產(chǎn)生破壞性的過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性、穩(wěn)定性及細(xì)胞的正常功能[9]。因此，通過(guò)抗氧化劑調(diào)節(jié)脂代謝是防治高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的重要措施[10]。流行病學(xué)研究證據(jù)指出，缺乏維生素B6是引發(fā)心、腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，與血脂水平聯(lián)系密切[11]。維生素B6主要以5-磷酸吡哆醛的形式作為轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)中的輔酶，參與α-氨基酸脫羧和外消旋作用以及脂質(zhì)和核酸的代謝，并且是糖原磷酸化酶的必需輔酶，能降低血同型半胱氨酸水平，減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。已證明吡哆醛與脂肪肝、高膽固醇血癥、總脂質(zhì)的蓄積有關(guān)，維生素B6可降低人群慢性疾病危險(xiǎn)性[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第0天，試驗(yàn)組血清硒水平及維生素B6水平與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，第30天，試驗(yàn)組血清硒水平及維生素B6水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)，表明受試者對(duì)干預(yù)物的有效成分能較好的吸收。維生素B6缺乏可干擾膽固醇的代謝[13]。維生素B6影響牛磺酸的生物合成和甘氨酸的分解代謝,調(diào)節(jié)膽酸與甘氨酸、?；撬岬慕Y(jié)合；當(dāng)結(jié)合膽酸排泄增加時(shí)，膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懰岬乃俣燃涌?從而降低體內(nèi)膽固醇的水平；體內(nèi)維生素B6缺乏時(shí)，則導(dǎo)致膽固醇水平升高。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組連續(xù)服用富硒酵母和維生素B6 30 d后，血清總膽固醇和LDL-C水平低于自身第0天水平，且低于對(duì)照組第30天水平(P均<0.05)，表明適量富硒酵母與維生素B6聯(lián)合干預(yù)能夠有效降低血脂水平。

在血漿脂蛋白代謝過(guò)程中，有許多脂酶起著很重要的作用，主要包括LPL、肝脂酶和HMGR。本研究發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)充富硒酵母與維生素B6 30 d后，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組血清HMGR水平降低，肝脂酶、LPL及總脂酶水平升高(P均<0.05)；肝臟的脂質(zhì)調(diào)控主要與脂肪合成和脂肪酸β-氧化的代謝平衡有關(guān)，脂肪合成主要受 SREBP-1c及由它介導(dǎo)的下游基因的調(diào)控，β-氧化主要由 PPARα、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1等基因調(diào)節(jié)。SIRT1是一個(gè)脂代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過(guò)抑制SREBP-1c增加脂肪酸代謝，防止脂質(zhì)在肝臟的蓄積[14]。同時(shí)，試驗(yàn)組全血SIRT1、PPARα mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，SREBP-1c mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P均<0.05)。本研究印證了硒與維生素B6通過(guò)上調(diào)SIRT1和PPARα，下調(diào)SREBP-1c等關(guān)鍵脂代謝調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，引起脂代謝酶HMGR水平降低，同時(shí)使肝脂酶、LPL及總脂酶的水平升高，從而限制了內(nèi)源性膽固醇的合成，加快膽固醇的外排并促使機(jī)體清理多余的脂肪酸與膽固醇，以達(dá)到調(diào)節(jié)脂代謝的效果。

然而，本試驗(yàn)結(jié)果中硒聯(lián)合維生素B6對(duì)降低高脂血癥人群血清甘油三酯水平未見顯著效果，原因可能是由于人體試驗(yàn)混雜因素難以控制，高甘油三酯血癥人群構(gòu)成比較低，加之甘油三酯水平不穩(wěn)定，同時(shí)人群試驗(yàn)樣本例數(shù)僅為90例，不是十分理想。因此，課題組會(huì)在后續(xù)研究中，優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用更加合理的抽樣方式，增加樣本例數(shù)，并加強(qiáng)質(zhì)量控制與偏差分析，使試驗(yàn)結(jié)果更加可靠。同時(shí)，本研究對(duì)富硒酵母聯(lián)合維生素B6調(diào)節(jié)脂代謝的機(jī)制研究沒(méi)有足夠深入，在以后的研究工作中需繼續(xù)對(duì)其機(jī)制進(jìn)行更加深入的探索。