尹 克 張素欣 段玉芹 陳 中 李天客

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，具有較強(qiáng)的侵襲性，常導(dǎo)致局部浸潤或早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]，且約60%的頭頸部癌癥患者就診時已到中晚期，致死率較高[2]。因此，OSCC 的早期診斷及治療對于患者的生存和發(fā)展及術(shù)后生活質(zhì)量的提高至關(guān)重要。研究[3～5]表明，MAFbx 可能具有潛在的腫瘤抑制功能，可以作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（EZH2） 抑制劑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。卵巢癌細(xì)胞MAFbx 的表達(dá)失活可能與其啟動子區(qū)甲基化有關(guān)。但是在OSCC 中關(guān)于MAFbx基因的作用及甲基化狀態(tài)的研究尚未見報(bào)道。本研究通過檢測OSCC 及相應(yīng)癌旁組織中MAFbx基因表達(dá)及甲基化狀態(tài)，分析其表達(dá)與甲基化的相關(guān)性，探討MAFbx在OSCC發(fā)生及發(fā)展中的作用及其與患者預(yù)后的關(guān)系，為OSCC 患者的靶向治療提供新思路。

材料和方法

1.臨床資料：隨機(jī)選取本院2010～2012年間的OSCC 患者手術(shù)切除標(biāo)本，共53 例。上述標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為口腔鱗癌組織和相應(yīng)的正?？谇火つ?。每例標(biāo)本均為術(shù)后半小時內(nèi)采集完成，液氮保存用于DNA 和RNA 的提取。其中男性31例，女性22例，年齡37～76 歲，中位年齡61 歲。吸煙25 例，不吸煙28 例；飲酒25例，不飲酒28例；Ⅰ期5例（9.43%），Ⅱ期30例（60.38%），Ⅲ期14 例（26.42%），Ⅳ期4例（7.55%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例（64.15%），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例（35.85%）。本研究中所有研究對象簽署知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。上述病例以患者術(shù)后出院為觀察起點(diǎn)，結(jié)合復(fù)診病歷，利用電話、電子通訊等手段對患者及其家屬進(jìn)行隨訪，隨訪截止于2017年12月。

2.主要試劑：RPMI 1640 培養(yǎng)液、胰酶（美國Gibco公司），5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）（Sigma公司）；蛋白酶K（Merck公司）；DNA 亞硫酸氫鹽純化試劑盒（德國QIAGEN 公司）；組織RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen 公司）；本研究所用引物均在北京賽百盛公司合成。

3 細(xì)胞培養(yǎng)：SCC-15和OC3細(xì)胞購自ATCC 細(xì)胞庫，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)，置于5% CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。取待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，加入5-Aza-dC（終濃度10μmol/L）作為實(shí)驗(yàn)組，以未經(jīng)5-Aza-dC 處理的細(xì)胞作為對照組。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h，其中每24h 更換培養(yǎng)液，之后換全血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h 后收集細(xì)胞并提取DNA 及RNA。

4.RT-qPCR 檢測口腔癌細(xì)胞系及OSCC 組織中MAFbx 的表達(dá):按TRIzol 試劑說明書提取細(xì)胞系中的RNA，按照組織RNA 提取試劑盒說明書提取53例組織中的總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用于檢測MAFbx 表達(dá)的引物為：上游：5’-AAGTCTGTGCTGGTCGGGAA-3’，下游5’-AGTGAAGGTGAGGCCTTTGAAG-3’（產(chǎn) 物123bp）；內(nèi)參照GAPDH 的引物序列為：上游5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下 游 5’-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’（產(chǎn) 物226bp）。qPCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40 個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示MAFbx基因的相對表達(dá)量，ΔCt ＝CtmRNA-CtGAPDH，ΔΔCt＝ΔCt病例組-ΔCt對照組。

5.BS-MSP 法檢測MAFbx 甲基化：采用常規(guī)酚/氯仿法提取5-Aza-dC 處理前后口腔癌細(xì)胞系和OSCC 患者組織的基因組DNA，按照亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒，每個樣本中均取2μg DNA，進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。運(yùn)用UCSC （University of California Santa Cruz）基因序列數(shù)據(jù)庫和Genebank 結(jié)合進(jìn)行序列檢索，在線軟件Methprimer 預(yù)測基因CpG 島分布情況，發(fā)現(xiàn)在MAFbx基因啟動子及部分第一外顯子區(qū)存在兩個CpG 島。本研究應(yīng)用BS-MSP 對啟動子區(qū)CpG 島進(jìn)行甲基化分析。并結(jié)合引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)第一輪PCR 引物，上下游引物序均不含有CG位點(diǎn)。在此片段范圍內(nèi)設(shè)計(jì)MSP 引物，引物擴(kuò)增范圍分別為：-475bp 到-288bp。以第一輪擴(kuò)增片段為模板加入MSP 引物再進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪PCR 引物序列為：上游：5'-TTGGTTAGTGATAGTTAAGG-3'；下游5'-TAACTTTATTTATAAACT-3'（產(chǎn)物519bp）。MSP引物序列為：甲基化引物序列：上游5'-TTAGTTTTGCGGACGGTTCGGGAGG-3'，下游5'-ACGCTTAAAAAAATACGCCCCGATC-3'（產(chǎn)物188bp）； 非甲基化引物序列：上游5'-TTAGTTTTGTGGATGGTTTGGGAGG-3'，下游5'-ACACTTAAAAAAATACACCCCAATC-3'（產(chǎn)物188bp）。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min 后，95℃變性45s，退火45s，72℃延伸1min，35 個循環(huán)后，72℃延伸7min。陽性對照選用經(jīng)甲基化酶（Sss I）處理的基因組DNA，滅菌雙蒸水取代DNA 模板進(jìn)行PCR 作為陰性對照。并隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 軟件包（22.0版）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以表示；計(jì)數(shù)資料采用檢驗(yàn)和校正檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用spearman 分析，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。預(yù)后分析采用Kaplan-Meier 生存曲線。以P＜0.05或P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.口腔癌細(xì)胞系中MAFbx 的表達(dá)及甲基化狀態(tài)（圖1）：5-Aza-dC 處理前后SCC-15 和OC3 細(xì)胞中MAFbx 的相對表達(dá)量分別為（0.265±0.021 vs 0.534±0.015）和（0.094±0.001 vs 0.455±0.039），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5-Aza-dC 處理前2種OSCC 細(xì)胞系中MAFbx基因均有甲基化條帶擴(kuò)出，經(jīng)過5-Aza-dC 處理后，OC3 細(xì)胞系中MAFbx甲基化程度降低，非甲基化程度增加，SCC-15 細(xì)胞系中MAFbx 表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。

2.OSCC 組織及相應(yīng)癌旁組織中MAFbx基因的mRNA 的相對表達(dá)量（圖2，表1）：OSCC 組織中MAFbx 的相對表達(dá)量為（1.000±0.001），顯著低于癌旁正常組織（1.813±0.392）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-12.973，P＜0.01）。

該基因的表達(dá)量與患者的TNM 分期[t＝3.019，P＜0.01）]和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[t＝-3.231，P＜0.01）]有關(guān)，而與患者的性別、年齡、吸煙、飲酒無關(guān)（P＞0.05）。

圖1 OSCC 細(xì)胞系中MAFbx基因mRNA 表達(dá)（A）及甲基化狀態(tài)（B）

3.MAFbx在OSCC 組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系（圖3）：對53 例OSCC 患者進(jìn)行隨訪，共8 人失訪，失訪率為15.1%。結(jié)果表明，MAFbx 低表達(dá)組（與癌旁組織相對表達(dá)量相比低于2 倍者為低表達(dá)）患者生存率為17.6%（28/34），平均生存時間為（30.79±3.01）個月；MAFbx 高表達(dá)組患者生存率為47.4%（10/19），平均生存時間為（47.73±4.48）個月。兩組生存率與生存時間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.642，P＜0.05；t＝-2.653，P＜0.05）。

4.OSCC 組織和相應(yīng)癌旁正常組織中MAFbx基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)（圖4，表1）：OSCC 組織中甲基化率為64.15%（34/53），顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織24.53%（13/53）（χ2＝16.858，P＜0.01）。分析53 例OSCC 患者的各臨床病理參數(shù)發(fā)現(xiàn)，該基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)與患者的TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者吸煙、飲酒、性別及年齡無關(guān)（P＞0.05）。

圖2 RT-qPCR 法檢測OSCC 組織中MAFbx基因的mRNA 表達(dá)

表1 OSCC組織中MAFbx基因表達(dá)水平及甲基化狀態(tài)與患者臨床病理資料的關(guān)系

圖3 MAFbx高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的生存曲線

同時，53 例OSCC 組織中，發(fā)生MAFbx 甲基化的組織中其mRNA 相對表達(dá)量顯著低于未發(fā)生甲基化的組織[（0.054±0.033）vs（0.090±0.047），t＝2.948，P＜0.01]。

圖4 BG-MSP法檢測OSCC組織中MAFbx基因甲基化狀態(tài)

討 論

MAFbx（也稱為atrogin-1）是F-box 蛋白家族的成員，最初被鑒定為肌肉特異性F-box 蛋白，并且構(gòu)成參與肌肉萎縮的蛋白連接酶復(fù)合物，在泛素化和靶蛋白活化或降解中起關(guān)鍵作用[6，7]。該基因定位于人染色體8q24.13，v-akt 鼠胸腺瘤病毒致癌基因（蛋白激酶B，AKT）信號通路對MAFbx 具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，且MAFbx 可能作為一種新型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中表達(dá)沉默，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8，9]。

近年來研究表明，MAFbx 啟動子區(qū)甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)沉默的重要機(jī)制之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[10]。DNA 甲基化作為人體中表觀遺傳事件之一，其甲基化模式的改變可能在腫瘤發(fā)生中起重要作用[11，13]。研究發(fā)現(xiàn)，異常的DNA甲基化是腫瘤發(fā)生過程中最早的分子事件之一，在正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中就可以被檢測到并且在某些條件下還可以被調(diào)節(jié)或逆轉(zhuǎn)[12]。因此，基因的異常DNA 甲基化檢測可能在惡性腫瘤早期篩查中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

Chou 等[14]在對卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MAFbx在卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失，其在卵巢癌中低表達(dá)可能與其DNA 啟動子區(qū)異常高甲基化有關(guān)；MAFbx高甲基化與晚期卵巢癌患者預(yù)后不良有關(guān)；MAFbx低表達(dá)可能增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。在對乳腺癌、結(jié)腸癌及食管癌的研究中，MAFbx基因啟動子區(qū)甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)沉默的重要抑制機(jī)制[15～17]。Guo 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，MAFbx在食管癌中甲基化率高達(dá)52.27%，其啟動子區(qū)甲基化與患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究結(jié)果顯示MAFbx在OSCC 細(xì)胞系及組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，且MAFbx 低表達(dá)與OSCC 患者不良預(yù)后有關(guān)。同時我們在編號為GSE38823 的表達(dá)譜芯片中發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC 處理SCC-15 細(xì)胞系后，MAFbx基因的表達(dá)較處理前上調(diào)。因此，本研究組推測MAFbx基因在OSCC 表達(dá)下調(diào)可能與DNA 甲基化有關(guān)，并可通過甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理后發(fā)生逆轉(zhuǎn)。本研究中選取口腔鱗癌系SCC-15 和OC3，應(yīng)用5-Aza-dC 處理后發(fā)現(xiàn)MAFbx 的mRAN 表達(dá)顯著上調(diào)。為了降低甲基化檢測的假陽性率，我們還應(yīng)用BG-MSP 的方法進(jìn)一步驗(yàn)證OSCC 細(xì)胞系及OSCC 組織中的甲基化情況，結(jié)果顯示MAFbx在OSCC 組織中呈高甲基化狀態(tài)，應(yīng)用5-Aza-dC 處理后細(xì)胞中呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)，提示甲基化可能是該基因在OSCC 中表達(dá)失活的重要機(jī)制之一。

此外，MAFbx 作為一種E3 泛素連接酶，參與EMT 相關(guān)的分子標(biāo)志物表達(dá)和潛在的表型變化過程[7]。在乳腺癌中，MAFbx基因可以靶向抑制KLF4，從而抑制腫瘤細(xì)胞體外生長和增殖[18]。MAFbx 過表達(dá)可以顯著增強(qiáng)5-FU 誘導(dǎo)的AGS/5-FU 和SGC-7901/5-FU 細(xì)胞凋亡，增加兩種胃癌細(xì)胞系對藥物的敏感性[19]。因此，對于該基因在OSCC 發(fā)生中作用機(jī)制的研究，可能為OSCC 的治療及預(yù)后評估提供新的分子靶點(diǎn)。