張偉，劉秀霞，楊艷坤，白仲虎

江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

木聚糖酶 (XynA) 是一種可將木聚糖催化成低聚木糖或木寡糖的一類酶的總稱，其切割部位為底物的β-1,4糖苷鍵，廣泛存在于細(xì)菌和真菌中，是一種重要的工業(yè)酶類，在飼料工業(yè)、造紙業(yè)和食品行業(yè)等具有較大的應(yīng)用價(jià)值[1]。木聚糖酶的生產(chǎn)與應(yīng)用已由Juturu等[1]和Paes等[2]作過相關(guān)綜述，并介紹了木聚糖酶的來源、結(jié)構(gòu)和相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)等。

目前，最常用于外源蛋白表達(dá)的宿主為大腸桿菌Escherichia coli，表達(dá)量高以及便于遺傳操作等使其成為蛋白表達(dá)的明星菌株。由于該宿主缺乏有效的分泌元件以及雙層細(xì)胞膜，使其主要用于胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白。Chen等通過對普魯蘭酶分子的CBM41和X25區(qū)簡化，得到的精簡普魯蘭酶能在PelB信號(hào)肽引導(dǎo)之下分泌到周質(zhì)空間，實(shí)現(xiàn)了普魯蘭酶在大腸桿菌中的分泌表達(dá)[3]。為了克服大腸桿菌作為表達(dá)宿主的缺點(diǎn)，如含有內(nèi)毒素、易形成包涵體及雙層細(xì)胞膜不利于蛋白分泌，人們開發(fā)了利用革蘭氏陽性菌為宿主的較為安全的表達(dá)體系來代替，如枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum表達(dá)體系等。作為表達(dá)宿主，枯草芽孢桿菌具有易于培養(yǎng)、安全和可分泌表達(dá)等[4]優(yōu)點(diǎn)，但部分情況下在表達(dá)蛋白過程中的錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致表達(dá)出的蛋白無活性，而利用谷氨酸棒桿菌則能正確地折疊蛋白并且具有活性[5]。谷氨酸棒桿菌自首次被分離出后就廣泛用于氨基酸的生產(chǎn)，如谷氨酸、賴氨酸、絲氨酸和異亮氨酸等[6-8]。除作為氨基酸和有機(jī)酸的生產(chǎn)菌株外，谷氨酸棒桿菌還是一種很有潛力的外源蛋白表達(dá)宿主。相對于大腸桿菌表達(dá)體系，谷氨酸棒桿菌表達(dá)體系有如下優(yōu)勢：可溶性表達(dá)外源蛋白，不易形成包涵體；細(xì)胞為單層膜，外源蛋白易于分泌到胞外，不需要破碎，純化較胞內(nèi)表達(dá)容易；不含內(nèi)毒素，比較安全[9]。在用谷氨酸棒桿菌進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)過程中，積累了大量的有關(guān)該菌的大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，可以利用這些技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)外源蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。隨著谷氨酸棒桿菌的基因組序列測定完畢[10]，對其進(jìn)行改造和構(gòu)建工程菌株更為容易。

目前，關(guān)于谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)外源蛋白的研究主要集中于載體元件的構(gòu)建和宿主的改造等。載體元件的選擇和構(gòu)建是進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的重要過程。啟動(dòng)子是表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵元件之一，通過控制轉(zhuǎn)錄影響外源蛋白的表達(dá)。啟動(dòng)子的來源可從宿主中進(jìn)行篩選，包括原有啟動(dòng)子的突變和人工合成突變等。宿主中篩選如趙子豪等以egfp為報(bào)告基因，通過Golden Gate法從谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到了與強(qiáng)啟動(dòng)子Pgro接近的AH6和Ptuf啟動(dòng)子[11-12]，來自谷氨酸棒桿菌中的Psod等也屬于較強(qiáng)的啟動(dòng)子并用于ScFv等的表達(dá)[13]，Zou等在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)GlyA時(shí)發(fā)現(xiàn)用強(qiáng)啟動(dòng)子Ptuf能降低5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量[14]，同添加過量絲氨酸結(jié)果相同；原有啟動(dòng)子的突變?nèi)鏩hang等通過構(gòu)建啟動(dòng)子突變庫，以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，篩選到了P69啟動(dòng)子，是tac啟動(dòng)子的1.9倍[15]；Liu等利用tac-M啟動(dòng)子結(jié)合CgR-S0949信號(hào)肽在谷氨酸棒桿菌中成功分泌表達(dá)了來自茂源鏈霉菌Streptomyces mobaraenseCICC 11018的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶[16]；人工突變合成啟動(dòng)子庫如Rytter等基于谷氨酸棒桿菌-10區(qū)的序列(gngnTA (c/t) aaTgg) 及大腸桿菌的-35區(qū)序列通過PCR突變法構(gòu)建了適用于谷氨酸棒桿菌的組成型啟動(dòng)子庫，并基于大腸桿菌的lac啟動(dòng)子的-10區(qū)和-35區(qū)之間序列的突變，構(gòu)建了誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子庫并用于β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)[17]；Yim等以gfp為報(bào)告基因，結(jié)合流式分選技術(shù)，通過隨機(jī)突變篩選了啟動(dòng)子PH36，并用于ScFv的表達(dá)[18]。除啟動(dòng)子外，核糖體結(jié)合位點(diǎn) (Ribosome binding site，RBS) 序列通過核糖體與mRNA的結(jié)合效率而影響著目的基因的表達(dá)[19]，并且RBS序列的改變還會(huì)影響轉(zhuǎn)錄效率間接引起翻譯水平的變化；Shi等通過合適的啟動(dòng)子和RBS序列組合使γ-氨基丁酸 (GABA) 在谷氨酸棒桿菌中的產(chǎn)量超過25 g/L[20]。若進(jìn)行分泌表達(dá)，信號(hào)肽是必不可少的元件，信號(hào)肽通過引導(dǎo)蛋白跨膜從而分泌到胞外，形成分泌表達(dá)，有利于下游的分離純化，這也是相對于大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)的優(yōu)勢所在。目前在谷氨酸棒桿菌中的信號(hào)肽主要有兩種途徑，分別為Sec依賴型和Tat依賴型，其中Sec依賴型信號(hào)肽轉(zhuǎn)運(yùn)非折疊蛋白[13]，而Tat型信號(hào)肽轉(zhuǎn)運(yùn)折疊蛋白[21]。蛋白如GFP僅能通過Tat型信號(hào)肽分泌到胞外，通過Sec途徑不能分泌或分泌出極少量的無活性的蛋白[5]；淀粉酶等既能通過Sec信號(hào)肽分泌，又能通過Tat型信號(hào)肽分泌[22-23]。在分泌表達(dá)外源蛋白時(shí)，需要根據(jù)蛋白特性選擇合適的信號(hào)肽。

目前在谷氨酸棒桿菌中所用的表達(dá)載體大都為單順反子形式，即啟動(dòng)子-5′UTR-目的基因；本研究中我們通過構(gòu)建雙順反子分泌表達(dá)載體用于外源蛋白的分泌表達(dá)。相對于單順反子載體而言多了第一順反子后續(xù)的38 bp堿基以利于核糖體沿著mRNA進(jìn)行翻譯，在遇到第二個(gè)SD序列以后，核糖體重新起始第二個(gè)順反子即目的基因的翻譯。利用此雙順反子載體以及合適的信號(hào)肽，成功分泌表達(dá)了來自天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces coelicolorA3(2)的木聚糖酶蛋白并在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)，并對其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。為谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)外源蛋白提供了一種可用的工具，為進(jìn)一步發(fā)掘谷氨酸棒桿菌基因組中基因功能、利用谷氨酸棒桿菌內(nèi)源元件進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α用于載體的構(gòu)建和擴(kuò)增；谷氨酸棒桿菌C.glutamicumCGMCC1.15647用于目的基因的表達(dá)。質(zhì)粒pxmj19和PUC-xynA由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Axygen公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ及T4 DNA連接酶購自Thermo公司；Q5超保真聚合酶購自NEB公司；氯霉素購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；Endo-Xylanase Assay Procedure購自Megazyme公司；HRP-conjugated anti-His購自Proteintech公司，顯色液購自Thermo公司；其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

電轉(zhuǎn)化儀和凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)為Thermo公司；核酸和蛋白電泳儀，北京六一儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌：37 ℃在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；谷氨酸棒桿菌：30 ℃在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在需要氯霉素抗性篩選時(shí)，在大腸桿菌中終濃度為15 mg/L，在谷氨酸棒桿菌中為10 mg/L。

1.1.4 引物合成和基因合成

實(shí)驗(yàn)中所用引物及分泌表達(dá)的載體AH6-PS2和AH6-0949由蘇州鴻訊生物科技有限公司構(gòu)建合成。上述兩個(gè)載體以pxmj19載體為基礎(chǔ)，帶有除木聚糖酶 (XynA) 以外的序列，包括AH6啟動(dòng)子[11]、5′ UTR及其前38 bp的序列 (Gene ID：NCgl1316)、SD2 (AAAGGAGGACAAC) 和信號(hào)肽。其余載體為實(shí)驗(yàn)室保存，載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2 方法

1.2.1 分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

AH6-09X和AH6-PSX的構(gòu)建：以xynAF (5′-C CGCTCGAGGCCGAGAGCACGCTCGGCG-3′) 和xynA (5′-CCGGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTG GTGGGTGCGGGTCCAGCGTTGGTTG-3′) 為 引物 (在C末端添加了6×His標(biāo)簽便于后續(xù)純化)，以PUC-xynA質(zhì)粒為模板擴(kuò)增木聚糖酶基因xynA序列。反應(yīng)體系為：5×緩沖液 10 μL、dNTPs(各10 mmol/L) 1 μL、上下游引物各2 μL、Q5 DNA聚合酶0.5 μL、模板1 μL，補(bǔ)足ddH2O至50 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，用T4 DNA連接酶分別連接到同樣經(jīng)過XhoⅠ和EcoRⅠ酶切之后的AH6-0949和AH6-PS2載體上，分別得到AH6-09X和AH6-PSX，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2.2 谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化

上述的AH6-09X和AH6-PSX載體通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中[24]。

1.2.3 木聚糖酶在5 L發(fā)酵罐中的分泌表達(dá)

將含有AH6-PSX載體的谷氨酸棒桿菌在培養(yǎng)12 h后，取200 mL培養(yǎng)物接種到含有1.8 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L Applikon Ez-control發(fā)酵罐中。培養(yǎng)基成分為 (g/L)：葡萄糖 30，BHI 30，(NH4)2SO420，MgSO41，KH2PO41。發(fā)酵過程中，pH值控制在7.0，通過氨水及10%的磷酸調(diào)節(jié)pH；溫度控制在30 ℃，溶氧控制在30%。在12 h開始補(bǔ)料 (300 g/L的葡萄糖)，在取樣之后用循環(huán)泵迅速補(bǔ)料32 mL。每隔4 h取一次樣，測定其OD600和發(fā)酵液上清的木聚糖酶活性，用DNS法測定葡萄糖含量。

圖1 木聚糖酶分泌表達(dá)載體結(jié)構(gòu)簡圖Fig.1 Brief architecture of vectors for XynA secretion.

1.2.4 分泌蛋白的檢測、純化及SDS-PAGE

木聚糖酶的檢測：按照Endo-Xylanase Assay Procedure試劑盒操作說明書進(jìn)行。酶活定義：在試劑盒標(biāo)準(zhǔn)測定條件下，每分鐘催化底物釋放20 nmol的4-硝基酚所需酶量為一個(gè)酶活單位。

木聚糖酶的純化：使用AKTA Purifier System(GE Healthcare) 進(jìn)行目的蛋白純化。帶有目的基因載體的谷氨酸棒桿菌在培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃、12 000×g離心5 min收集培養(yǎng)物上清。取25 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的樣品上樣到經(jīng)過A液(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，pH 8.0) 平衡過的鎳柱上，然后用A液繼續(xù)平衡5個(gè)柱體積以洗下未與鎳柱結(jié)合的雜蛋白。平衡完畢后，用50%的B液 (20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0) 洗脫，收集帶有蛋白峰洗脫液。

蛋白的純度分析通過SDS-PAGE進(jìn)行，分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為4%。電泳電壓為100 V，結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，脫色后置于凝膠成像儀拍照。Western blotting操作按照之前報(bào)道[25]進(jìn)行，以 HRP-conjugated anti-His為抗體進(jìn)行檢測。

1.2.5 最適pH及酸堿穩(wěn)定性

最適pH測定：分別在不同pH值的緩沖液配制木聚糖酶催化底物和稀釋酶液，測定木聚糖酶的活性。酸堿穩(wěn)定性測定：選用不同pH值的緩沖液稀釋酶液，于4 ℃冰箱存放24 h后測定木聚糖酶活性。以其中的最高酶活為100%，其余條件下測定的酶活以相對百分比與之相比較。pH的范圍為3.0–12.0，其中pH 3.0–6.0所用的緩沖液為100 mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH 7.0–8.0為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 9.0–10.0為100 mmol/L的Gly-NaOH緩沖液，pH 11.0–12.0為Na2HPO4-NaOH緩沖液。

1.2.6 最適溫度及熱穩(wěn)定性

最適溫度測定：分別在20–80 ℃條件下測定木聚糖酶的活性，其余參數(shù)同標(biāo)準(zhǔn)條件。溫度穩(wěn)定性測定：分別將木聚糖酶在20–80 ℃條件下處理15 min，然后在40 ℃條件下測定木聚糖酶的活性。以酶活最高的一組定為100%，其余條件下測定的酶活以相對百分比與之相比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的構(gòu)建

載體AH6-09X和AH6-PSX的主要結(jié)構(gòu)如圖1所示，除一般載體所共有的復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基因等之外，上述兩個(gè)載體都是雙順反子形式的載體。含有AH6啟動(dòng)子，AH6啟動(dòng)子為本實(shí)驗(yàn)室前期在谷氨酸棒桿菌中篩選到的表達(dá)EGFP效果較好的內(nèi)源啟動(dòng)子[11]，以AH6基因的前38 bp為第一順反子，第二個(gè)SD序列來自16S rRNA中出現(xiàn)較高頻率的序列[26]，信號(hào)肽基因cgR0949和cspB來自谷氨酸棒桿菌自身，分別為Tat和Sec依賴型，為谷氨酸棒桿菌的兩種主要的分泌途徑。構(gòu)建雙順反子載體的原因是：雙順反子形式能通過第一順反子 (38 bp) 的翻譯使核糖體能夠結(jié)合到mRNA上，以及改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)更有利于翻譯進(jìn)行，在核糖體遇到第二個(gè)SD序列之后，可以重新起始下一個(gè)順反子的翻譯，從而表達(dá)第二順反子即目的基因。在目的基因前加上信號(hào)肽能引導(dǎo)目的蛋白分泌到胞外，形成分泌表達(dá)。在大腸桿菌中，雙順反子結(jié)構(gòu)表達(dá)較單順反子穩(wěn)定[27]，在谷氨酸棒桿菌中，雙順反子形式的表達(dá)往往優(yōu)于單順反子表達(dá)[11,19]。

2.2 木聚糖酶的表達(dá)及其分泌

將構(gòu)建好的載體分別轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)的木聚糖酶酶活通過超聲破碎后檢測，分泌表達(dá)的木聚糖酶酶活取發(fā)酵液上清進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖2所示，在帶有AH6-PSX載體的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液上清中檢測到木聚糖酶活性為486.2 U/mL，說明木聚糖酶能夠由本載體中的啟動(dòng)子和SD等原件啟動(dòng)表達(dá)，并且在CspB信號(hào)肽的引導(dǎo)下能夠分泌到胞外，上清經(jīng)過鎳柱一步純化即可得到較為單一的條帶 (圖2)；在帶有AH6-09X載體的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液上清中檢測不到木聚糖酶活性，說明在此表達(dá)體系中，木聚糖酶不能通過CgR0949信號(hào)肽分泌到胞外。在胞內(nèi)，木聚糖酶在AH6-09X中的表達(dá)量為69.8 U/mL，稍高于在AH6-PSX中的表達(dá)量48 U/mL，可能是由于木聚糖酶在AH6-PSX中能分泌到胞外，而在AH6-09X中不能分泌到胞外，在胞內(nèi)積累，因此高于在AH6-PSX中含量。但由于表達(dá)量都低于在AH6-PSX中的分泌表達(dá)量，因此，分泌表達(dá)是較優(yōu)的選擇。

圖2 木聚糖酶在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達(dá)Fig.2 Secretion of XynA in C.glutamicum.(A)SDS-PAGE gel (lanes 1–5) of XynA production.Lane M:protein molecular mass marker; lane 1: sample from wild type C.glutamicum; lane 2: sample from C.glutamicum harboring pxmj19; lane 3: sample from C.glutamicum harboring AH6-09X; lane 4: sample from C.glutamicum harboring AH6-PSX; lane 5: purified XynA.(B) Western blotting analysis (lanes 1–3) of XynA production.Lane 1:sample from C.glutamicum harboring AH6-09X; lane 2:sample from C.glutamicum harboring AH6-PSX; lane 3:purified XynA.

上述結(jié)果說明，木聚糖酶在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達(dá)優(yōu)于胞內(nèi)表達(dá)，并對信號(hào)肽具有選擇性，適合于通過Sec型的信號(hào)肽分泌而不適于通過Tat型的信號(hào)肽分泌。蛋白分泌到胞外可不經(jīng)過菌體破碎而直接純化，簡化了純化過程，在工業(yè)化生產(chǎn)上能有效節(jié)約成本。同時(shí)谷氨酸棒桿菌為食品級安全菌，結(jié)合分泌表達(dá)，使得谷氨酸棒桿菌成為極具潛力的外源蛋白表達(dá)宿主。

2.3 木聚糖酶在5 L發(fā)酵罐的分泌表達(dá)

為了進(jìn)一步提高本表達(dá)體系中木聚糖酶分泌表達(dá)能力，我們在5 L發(fā)酵罐對重組菌進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，接種之后，葡萄糖濃度維持在20–30 g/L，菌體的濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，在第8小時(shí)時(shí)木聚糖酶的分泌表達(dá)量即接近了搖瓶水平 (481.8 U/mL) ，第12 h時(shí)分泌量首次超過搖瓶水平 (702.8 U/mL)，到第36 h菌體濃度達(dá)到最大，而后開始下降。SDS-PAGE圖上也可以看到在接種后培養(yǎng)4 h后即出現(xiàn)分泌的木聚糖酶蛋白條帶，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而增大濃度。經(jīng)過酶活檢測，木聚糖酶的活性在第36 h即達(dá)到最大，為1 648.7 U/mL，分泌量是搖瓶水平的3.4倍。同時(shí)由圖3A可知，木聚糖酶的分泌和菌體的生長有一定的關(guān)系，木聚糖酶的分泌量緊隨菌體的總量，可通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化進(jìn)一步利于菌體的生長及提高蛋白的分泌量。除此之外，強(qiáng)啟動(dòng)子能夠提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，目的基因密碼子優(yōu)化能夠使原有的稀有密碼子減少，對應(yīng)氨基酸的tRNA相對增加，從而提高蛋白翻譯效率[13]；在分泌表達(dá)時(shí)，信號(hào)肽效率的提高和目的蛋白在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中障礙的減少如宿主細(xì)胞壁的改造能有效提高蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率而提高蛋白分泌水平[28]。

2.4 木聚糖酶最適pH和酸堿穩(wěn)定性

最適pH：如圖4A所示，在pH 3–12之間測定木聚糖酶活性時(shí)，在pH 5–7之間相對酶活保持在90%以上；pH值小于4或大于9時(shí)，酶活發(fā)揮不足最高酶活的54%，說明該木聚糖酶在此pH條件下不利于催化底物降解。為進(jìn)一步確定最適催化pH，在pH 5上下分別選擇pH 4.5和pH 5.5進(jìn)行酶活測定。結(jié)果表明，在pH 4.5時(shí)的酶活為pH 5時(shí)的1.02倍，說明該木聚糖酶的最適催化pH在4.5左右。

圖3 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶過程圖Fig.3 Fed-batch cultivation of C.glutamicum (AH6-PSX) for XynA production in a 5 L fermentor.(A) Profiles of cell growth (●), glucose concentration (?) and activity of XynA (■).(B) SDS-PAGE of culture supernatant during cultivation.Lane M: protein molecular mass marker; lane 1–13: supernatant samples taken at 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h,40 h, 44 h, 48 h, 52 h after inoculation.Arrow indicates XynA.

圖4 木聚糖酶的最適pH和酸堿穩(wěn)定性Fig.4 The optimal pH and pH stability of XynA.(A) Optimal pH.(B) pH stability.

酸堿穩(wěn)定性：如圖4B所示，pH穩(wěn)定性測試結(jié)果表明該酶在pH 3–11時(shí)較為穩(wěn)定，處理后殘余酶活能保持在84%以上，在此較寬的pH范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。在pH低于3或高于12，處理后殘余酶活降至30%以下，可能是因?yàn)檫^酸或是過堿都會(huì)對酶本身造成損害，從而導(dǎo)致酶活的降低。

2.5 木聚糖酶最適溫度和熱穩(wěn)定性

最適溫度：如圖5A所示，在20–80 ℃測該木聚糖酶的最適催化溫度時(shí)，催化效率最高為40 ℃；酶活在30–60 ℃都能發(fā)揮60%以上活力；低于20 ℃酶活效力低于40%，而高于70 ℃酶活效率低于20%，說明此溫度范圍內(nèi)不適于發(fā)揮酶活。為進(jìn)一步精確該酶最適催化溫度，在40 ℃上下分別選擇35 ℃和45 ℃進(jìn)行酶活測定。結(jié)果表明，在45 ℃時(shí)木聚糖酶的催化活性是40 ℃時(shí)的1.07倍，說明該木聚糖酶的最適催化溫度在45 ℃左右。

圖5 木聚糖酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.5 The optimal temperature and thermostability of XynA.(A) Optimal temperature.(B) Thermostability.

熱穩(wěn)定性：如圖5B所示，熱穩(wěn)定性測試結(jié)果表明該木聚糖酶在50 ℃前處理后殘余酶活能保持在95%以上，在此溫度范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。超過60 ℃，處理后殘余酶活降低至20%及其以下，說明溫度對該木聚糖酶影響明顯。在20 ℃時(shí)木聚糖酶雖能保持穩(wěn)定，但由于溫度不適于催化，因此不能有效發(fā)揮酶活；而超過60 ℃時(shí)，酶活較低的原因除催化溫度不適外，高溫對酶本身有一定的損害，二者共同作用所致。

3 討論

谷氨酸棒桿菌作為氨基酸和有機(jī)酸的生產(chǎn)菌，是一種GRAS (Generally regarded as safe) 菌，同時(shí)也是一種有潛力的外源蛋白表達(dá)宿主。利用谷氨酸棒桿菌作為宿主進(jìn)行外源蛋白表達(dá)所需的表達(dá)元件來源廣泛，本實(shí)驗(yàn)所用的表達(dá)載體中的關(guān)鍵元件均來自谷氨酸棒桿菌自身。第一順反子的啟動(dòng)子AH6來自谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)錄組中篩選到轉(zhuǎn)錄效果較強(qiáng)的內(nèi)源啟動(dòng)子，結(jié)合合適的SD序列已經(jīng)成功用于EGFP的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該表達(dá)框能否用于其他外源蛋白的表達(dá)及能否結(jié)合信號(hào)肽進(jìn)行分泌表達(dá)，我們用木聚糖酶作為測試蛋白，木聚糖酶在內(nèi)源的AH6啟動(dòng)子和SD序列等元件作用下在谷氨酸棒桿菌表達(dá)之后，在內(nèi)源的Sec依賴型信號(hào)肽CspB的引導(dǎo)下，成功分泌到胞外，說明谷氨酸棒桿菌內(nèi)源元件組合能夠用于木聚糖酶的分泌表達(dá)，并且分泌表達(dá)量高于胞內(nèi)表達(dá)量。進(jìn)一步驗(yàn)證了木聚糖酶適合于通過Sec途徑進(jìn)行分泌，和文獻(xiàn)報(bào)道利用Sec型信號(hào)肽PorB分泌木聚糖酶一致[29]。木聚糖酶的分泌表達(dá)量在5 L發(fā)酵罐水平是搖瓶培養(yǎng)的3.4倍，說明擴(kuò)大培養(yǎng)能有效提高木聚糖酶的生產(chǎn)，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程中有補(bǔ)料添加和通氧等利于菌體生長的因素，這有利于木聚糖酶分泌和積累。而木聚糖酶的積累隨著宿主生長變化而變化，可通過進(jìn)一步的優(yōu)化培養(yǎng)條件提高菌體的生長狀況以進(jìn)一步提高蛋白的分泌量。木聚糖酶種類多樣，有酸性和堿性之分，本實(shí)驗(yàn)用的木聚糖酶屬于酸性，等電點(diǎn) (pI) 為酸性，最適pH為4.5在酸性范圍內(nèi)；在45 ℃時(shí)酶能發(fā)揮最大催化效率，并且在此溫度下穩(wěn)定性較好，有利于持續(xù)的酶活發(fā)揮。Liu等報(bào)道在法夫駒形氏酵母Komagataella phaffii中表達(dá)的來自黑曲霉Aspergillus niger的木聚糖酶產(chǎn)量為1 827.19 U/mL，該木聚糖酶的最適溫度和最適pH分別為55 ℃和5.0[30]，和本實(shí)驗(yàn)中的木聚糖酶有一定差異，可能是酶的來源及結(jié)構(gòu)不同所致。不同木聚糖酶之間酶學(xué)性質(zhì)差異較大，不同來源的木聚糖酶其分子量、pI、最適催化pH和最適催化溫度等已在Paes等綜述中作了介紹[2]。

本研究提供了一種利用谷氨酸棒桿菌的內(nèi)源元件構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體，用于木聚糖酶的分泌表達(dá)，驗(yàn)證了AH6啟動(dòng)子能夠用于除EGFP之外的蛋白的表達(dá)，并且能夠在合適的信號(hào)肽引導(dǎo)下進(jìn)行分泌表達(dá)。至于本表達(dá)體系能否用于其他蛋白的分泌表達(dá)，有待于進(jìn)一步的研究；并且AH6啟動(dòng)子并非是最強(qiáng)啟動(dòng)子，若要進(jìn)一步提高蛋白的表達(dá)量，可以通過更換較強(qiáng)的啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，密碼子的優(yōu)化、合適的SD序列、強(qiáng)信號(hào)肽的選擇、宿主的改造如分泌過程中障礙的減少都能有助于蛋白的分泌。