岳曉平，陳朋，朱玥明，曾艷，劉漢民，劉紅彥，王敏，孫媛霞

1 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457

2 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

3 中恩 (天津) 醫(yī)藥科技有限公司，天津 300308

酸性蛋白酶又稱天冬氨酸蛋白酶，主要來源于動物臟器和微生物分泌物，是一種適合在酸性條件 (pH 2.0–5.0) 下水解蛋白質的酶類，其被廣泛應用于食品[1-7]、畜牧[8-9]、醫(yī)學[10]、皮革[11]以及水產(chǎn)加工[12]等領域。酸性蛋白酶主要通過微生物發(fā)酵獲得。產(chǎn)酸性蛋白酶的菌種包括黑曲霉、紅曲霉、宇佐美曲霉、米曲霉等。

米曲霉作為美國FDA公布的安全菌株，具有蛋白酶系豐富、酶活高、不產(chǎn)毒素等諸多優(yōu)點，是我國傳統(tǒng)釀造食品醬、醬油和酒類的主要生產(chǎn)菌種[13-14]。然而，米曲霉菌株普遍產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶的能力較強而產(chǎn)酸性蛋白酶的能力偏弱[15]，目前對米曲霉來源酸性蛋白酶的研究主要集中于菌株的篩選與誘變、產(chǎn)酶條件優(yōu)化、酶學特性研究等方面[16-19]，有關米曲霉酸性蛋白酶基因異源表達與酶學性質研究尚未有報道。此外，米曲霉酸性蛋白酶主要通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，存在發(fā)酵周期長、勞動強度大、質量不穩(wěn)、純化困難等缺點，限制了其規(guī)模化生產(chǎn)。

基于巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris的蛋白表達系統(tǒng)具有雜蛋白分泌較少、培養(yǎng)成本低廉、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)點[20-26]，具有實現(xiàn)米曲霉酸性蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。本研究通過宏基因組測序，從發(fā)酵豆制品中獲得米曲霉酸性蛋白酶的編碼基因pepA，并在畢赤酵母中實現(xiàn)異源表達，同時對重組酸性蛋白酶的酶學特性展開研究，以期為米曲霉來源酸性蛋白酶的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

畢赤酵母GS115菌株、pPIC9K質粒均為本實驗室保存；大腸桿菌Escherichia coliDH5α、Trelief? SoSoo Cloning Kit購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司；Plasmid Mini KitⅠ、Cycel-pure Kit、Gel Extraction Kit購自美國OMEGA Bio-Tek公司；限制性內切酶BamHⅠ、限制性內切酶NotⅠ、dNTPs購自上海Fermentas公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖購自英國OXOID公司；甲醇購自美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。大腸桿菌培養(yǎng)基LB、畢赤酵母培養(yǎng)基YPD、選擇培養(yǎng)基MD、誘導表達培養(yǎng)基BMGY和BMMY的培養(yǎng)基配方見Invitrodgen公司畢赤酵母操作手冊。

1.2 方法

1.2.1 酸性蛋白酶基因的獲取

提取發(fā)酵豆制品微生物菌群宏基因組，利用二代測序技術進行測序。通過功能基因注釋，挖掘獲得酸性蛋白酶基因。

1.2.2 重組表達載體pPIC9K-pepA的構建

以特異性引物AOX-F1和AOX-R1 (序列見表1) 擴增目的基因pepA，回收PCR產(chǎn)物。用限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ對表達質粒pPIC9K進行雙酶切，純化回收線性化質粒。在55 ℃條件下利用重組酶Trelief? SoSoo Cloning Kit進行重組，將重組產(chǎn)物轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，提取質粒，用BamHⅠ和NotⅠ進行雙酶切驗證并測序。

1.2.3 畢赤酵母重組菌株的構建與篩選

將構建成功的重組表達質粒pPIC9K-pepA與畢赤酵母GS115感受態(tài)混合，混勻后，轉入冰預冷的0.2 cm電轉杯，冰上放置1 min后電擊(1.5 kV、25 μF、200 Ω、6 ms)轉化，電轉結束后迅速加入1 mL 1 mol/L冰預冷的無菌山梨醇至杯中，于超凈臺內將所有溶液轉至滅菌離心管中，30 ℃下靜置培養(yǎng)1 h后，取300 μL涂布于MD平板，30 ℃下倒置培養(yǎng)3-4 d后，隨機挑取若干單菌落，用YPD液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h，提取染色體DNA，以表達載體pPIC9K的通用引物AOX-F、AOX-R進行PCR鑒定，鑒定成功的菌株通過酶活力測定進一步篩選。

1.2.4 重組菌株的誘導表達

畢赤酵母含有醇氧化酶基因啟動子(PAOX1)，在甲醇的誘導下，PAOX1可驅動外源基因大量表達[27]。將篩選成功的菌株接種于含5 mL YPD培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，按2%體積將種子液接種于含50 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，離心收集菌體，然后全部轉入含50 mL 的BMMY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h添加甲醇至終濃度為0.5%，每隔24 h取樣檢測菌液濃度及發(fā)酵上清液酸性蛋白酶活力，實驗重復3次，上清液濃縮后進行SDS-PAGE分析[27]。

1.2.5 重組蛋白的酶活力測定

酶活力測定參考GB 1886.174-2016 食品安全國家標準，以1%的酪蛋白為底物，采用Folin-酚法進行酶活測定。以1 mL液體酶在40 ℃和pH 3.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位，用U/mL表示。

1.3 酶學性質分析

1.3.1 最適反應溫度與溫度穩(wěn)定性

按1.2.5的方法，在30–60 ℃，每間隔10 ℃取樣測定酶活，每個反應設3個平行，以最高酶活為100%，計算其他不同溫度下的相對酶活，確定酶的最適反應溫度。

將酶液分別置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃水浴鍋中，保溫15 min后取出酶液，測定殘余酶活力，每個反應設3個平行，以所測最高酶活為100%，計算各個溫度條件下的相對酶活，考察不同溫度下的熱穩(wěn)定性。

1.3.2 最適反應pH與pH穩(wěn)定性

在pH 2.0-7.0下測定酶活，以最高酶活力為100%，計算其他不同pH下的相對酶活，每個反應設3個平行，探討不同pH值對酶活力的影響。

將酶液置于pH 1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0的反應體系中，2 h后取出酶液，測定殘余酶活力，每個反應設3個平行，以所測最高酶活為100%，計算各個pH條件下的相對酶活，確定酶的pH值穩(wěn)定性。

表1 構建pPIC9K-pepA所用的引物Table 1 Primers used for construction of pPIC9K-pepA

1.3.3 金屬離子對酶活力的影響

為分析金屬離子對該酸性蛋白酶的影響，將不同的金屬離子(Fe3+、Al3+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Ca2+、Na+、K+、Ag+)分別添加到酸性蛋白酶酶反應體系中，使金屬離子終濃度為5 mmol/L，以不加金屬離子的樣品酶活為100%，每個反應設3個平行，計算不同金屬離子存在下的相對酶活，考察金屬離子對酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 米曲霉酸性蛋白酶基因的克隆與重組載體的構建

利用二代測序技術對發(fā)酵豆制品進行宏基因組測序，通過功能基因注釋，挖掘得到一種酸性蛋白酶基因pepA，其長度為1 215 bp，共編碼287個氨基酸。利用MEGA4.6軟件對不同微生物來源的酸性蛋白酶氨基酸序列構建進化樹 (圖1)，并進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該酸性蛋白酶與來自米曲霉RIB40的酸性蛋白酶 (GenBank基因登錄號: XM_001824123.3) 的序列完全一致[28]，與來自煙曲霉af293的酸性蛋白酶相似性為70.69%[29]，與來自黑曲霉CBS 513.88的酸性蛋白酶相似性為66.58%[30]。

以提取的宏基因組為模板，經(jīng)引物AOX-F1和AOX-R1 PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)PCR擴增，得到1 200 bp左右的片段(圖2)。在55 ℃條件下進行重組，將重組產(chǎn)物轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，獲得重組菌，提取質粒，經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，如圖3所示，得到兩條大小分別為9 000 bp和1 200 bp的兩條帶，表明目的基因已經(jīng)插入到pPIC9K載體上。測序結果表明該轉化菌的質粒中確實含有目的基因片段，且閱讀框正確，表達質粒pPIC9K-pepA構建成功。

2.2 重組菌株的誘導表達

利用電轉化的方式將表達質粒pPIC9K-pepA轉入畢赤酵母GS115，利用組氨酸缺陷型MD培養(yǎng)基篩選陽性轉化子，提取重組酵母菌基因組DNA，以其為模板，利用畢赤酵母表達載體通用引物AOX-F、AOX-R和目的基因特異性引物AOX1-F、AOX1-R進行PCR鑒定[31]。從圖4可以看出，使用表達載體通用引物，陽性重組菌擴增出1 600 bp左右的片段，使用基因特異性引物，擴增出1 200 bp左右片段，條帶大小與理論值相符，證明pPIC9K-pepA與畢赤酵母GS115染色體基因組重組成功。

圖1 米曲霉酸性蛋白酶PepA與其他微生物來源酸性蛋白酶的氨基酸序列進化樹Fig.1 The phylogenetic tree based on the protein sequences of PepA from Aspergillums oryzae with other microbial acidic protease.

圖2 pepA基因的PCR擴增電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified.M: DNA marker; 1: PCR products with pepA.

圖3 畢赤酵母表達質粒酶切鑒定Fig.3 Identification of expression plasmids for P.pastoris by digestion.M: DNA marker; 1: product of double enzyme digestion.

圖4 轉化子的PCR鑒定結果Fig.4 Identification of transformant by PCR.M: DNA marker; 1: PCR products with universal primer; 2: PCR products with specific primer.

將陽性菌株接種于以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)1 d后，收集菌體進行甲醇誘導培養(yǎng)，每隔24 h取樣，進行菌體濃度和酶活的測定 (如圖5所示)，隨著發(fā)酵的不斷進行，重組菌株濃度也逐漸增加，當發(fā)酵4 d后，菌體濃度達到最大，OD600達到45，此時酶活也達到最高，大約為50.62 U/mL。

酸性蛋白酶經(jīng)誘導表達后，取上清液進行離心、超濾濃縮，取濃縮后的上清蛋白進行SDS-PAGE分析，結果如圖6所示，分子量50 kDa處有明顯的條帶，無明顯雜蛋白，可以開展后續(xù)酶學性質方面的研究。

圖5 重組畢赤酵母菌株產(chǎn)酶時間曲線Fig.5 The time course of the enzyme activities produced by the engineered P.pastoris strain.

圖6 濃縮后酶的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of the concentrated enzyme.M: protein marker; 1: concentrated enzyme; 2: control.

2.3 酶學性質分析

2.3.1 最適溫度與溫度穩(wěn)定性

如圖7A所示，該酶最適反應溫度為50 ℃。當?shù)陀?0 ℃時，隨著反應溫度的升高，酶活力逐漸增加。在50 ℃下，酶活力最高，為30 ℃下的2.5倍，但高于50 ℃時，酶活力隨著反應溫度的升高迅速下降。溫度為60 ℃時，該酶基本失活。由圖7B可知，該酶在40 ℃以下放置15 min后仍然具有較高的活性。

2.3.2 最適反應pH值與pH穩(wěn)定性

該酸性蛋白酶的最適pH為4.5 (圖8A)。當pH<4.5時 (2.0-4.5)，隨著pH值的增加，酸性蛋白酶的酶活力逐漸增大。酸性蛋白酶在pH 4.5下的酶活力是pH 2.0下酶活力的6倍。但當pH>4.5時，隨著pH值的增加，酸性蛋白酶的相對酶活力迅速降低。圖8B為酸性蛋白酶在pH 1.0–7.0下的穩(wěn)定性。由圖可知，該酸性蛋白酶在pH 3.0–4.0下放置120 min后，相對酶活仍可達70%以上。

圖7 溫度對重組酸性蛋白酶PepA活性 (A) 和穩(wěn)定性 (B) 的影響Fig.7 Effect of temperature on the activity (A) and stability (B) of recombinant PepA.

2.3.3 常見金屬離子對酸性蛋白酶活性的影響

金屬離子可以影響酶結構的正確折疊，進而影響酶活力。為分析金屬離子對酸性蛋白酶酶活力的影響，以不添加金屬離子的反應體系為對照，測定不同金屬離子(Fe3+、Al3+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Ca2+、Na+、K+和Ag+)對酶活力的影響。如圖9所示，該酸性蛋白酶可顯著被Mn2+和Cu2+激活。添加5 mmol/L的Mn2+和Cu2+時，該酸性蛋白酶的酶活力分別為對照的2.6 倍和1.3倍。而Fe3+、Fe2+與Ca2+對酸性蛋白酶具有顯著的抑制作用。由此可見，不同的金屬離子對酸性蛋白酶酶活力具有不同的激活或抑制作用。

圖8 pH對重組酸性蛋白酶PepA的酶活 (A) 和穩(wěn)定性 (B) 的影響Fig.8 Effects of pH on the activity (A) and stability (B)of recombinant PepA.

圖9 金屬離子對酸性蛋白酶活性的影響Fig.9 Effect of metal ions on the activity of acid protease.

3 討論

酸性蛋白酶在制革工業(yè)、食品行業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)應用廣泛，然而卻受到酶不易獲取、分離純化困難、酶學性質不穩(wěn)定等因素限制。由于畢赤酵母表達系統(tǒng)菌株穩(wěn)定，發(fā)酵水平高，分泌能力強，自身蛋白分泌少[32]，目前已有黑曲霉、宇佐美曲霉、牛胃、豬胃等來源的酸性蛋白酶實現(xiàn)了在畢赤酵母中的異源表達，卻少有米曲霉酸性蛋白酶的相關報道。

宏基因組技術將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個整體，自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關系，可以從微生物的天然環(huán)境中直接提取基因組遺傳物質和尋找新基因，大大地拓展了微生物學的研究思路與方法[33]。本研究利用宏基因組測序及注釋技術從發(fā)酵豆制品中獲得了編碼來源于米曲霉的酸性蛋白酶基因pepA，盡管與來源于米曲霉RIB40的酸性蛋白酶基因序列一致，然而，到目前為止尚未見到由這一基因序列表達的酸性蛋白酶的酶學性質報道。此外，調研也沒有獲得其他米曲霉來源、可與pepA進行同源序列對比的酸性蛋白酶基因序列。

本研究基于分泌型表達載體pPIC9K攜帶的外源基因表達可抑制畢赤酵母自身蛋白表達的特點[34]，利用pPIC9K載體，首次在畢赤酵母GS115中成功表達了米曲霉來源的酸性蛋白酶基因pepA。發(fā)酵所得上清液中蛋白組分單一，重組酸性蛋白酶活力約為50.62 U/mL。王鑫等[35]將來自黑曲霉CBS 513.88、與PepA相似性為66.58%的酸性蛋白酶在畢赤酵母中進行表達，測得重組黑曲霉酸性蛋白酶的酶活為8.76 U/mL。邱重晏[36]研究了粗糙脈孢霉酸性蛋白酶基因在畢赤酵母S115中的表達，測得重組粗糙脈孢霉酸性蛋白酶最高酶活為6.8 U/mL。與上述研究相比，本研究的重組酸性蛋白酶的酶活較高。而且，隨著后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化以及密碼子優(yōu)化等分子生物學實驗的開展，PepA的酶活力可進一步提高。

Tsujita和End[37]發(fā)現(xiàn)來自米曲霉365-U-64-1的酸性蛋白酶具有底物選擇特異性。在以牛血清蛋白為底物時，最適pH值為4.2，在pH 5.0、50 ℃下加熱10 min，仍可保持70%以上的酶活。Vishwanatha等[38]發(fā)現(xiàn)米曲霉MTCC 5341分泌的酸性蛋白酶最適溫度和pH值分別為55 ℃和3.2，在40-57 ℃和pH 2.5-6.0下可保持一定的穩(wěn)定性。Yin等[39]發(fā)現(xiàn)來自米曲霉BCRC 30118的酸性蛋白酶最適溫度和pH值分別為60 ℃和3.0，F(xiàn)e2+、Fe3+與Hg2+會抑制酶活。王鑫等[35]則發(fā)現(xiàn)由黑曲霉CBS 513.88分泌的酸性蛋白酶最適溫度和pH分別為50 ℃和3.0，F(xiàn)e2+、Ca2+和Mn2+可促進酶活，而Cu2+和Fe3+則可抑制酶活。本研究中的重組米曲酸性蛋白酶PepA 的酶學性質與上述報道的曲霉酸性蛋白酶存在一定的差異，其最佳溫度為50 ℃，40 ℃下較為穩(wěn)定，最適pH為4.5，在pH 3.0-4.0酶活力較為穩(wěn)定，金屬離子Mn2+和Cu2+是該酶的激活劑，而Fe2+、Fe3+和Ca2+對酶活抑制程度較大。文獻表明畢赤酵母表達蛋白的糖基化會影響其分泌及功能[40]。當糖基化修飾發(fā)生在表達蛋白的折疊有序區(qū)域時，會降低其穩(wěn)定性[41]。如馬清等[42]推斷N-糖基化修飾導致畢赤酵母異源表達的β-甘露聚糖酶其局部結構改變，使之變?yōu)橄鄬Σ荒蜔岬慕Y構，導致其熱穩(wěn)定性下降。王越等[43]認為畢赤酵母對蛋白的過度化糖基修飾，會造成產(chǎn)物的活性位點遮蔽。因此，雖然缺少天然野生型PepA的酶學性質信息，但考慮到PepA潛在多個N-糖基化修飾位點，推測PepA的酶學性質差異可能與其在畢赤酵母表達過程中的多肽鏈的錯誤折疊及蛋白糖基化作用有關[44]。

本研究實現(xiàn)了米曲霉酸性蛋白酶在畢赤酵母中的異源表達并對其酶學性質進行了表征，為酸性蛋白酶的異源表達研究及應用推廣提供了借鑒參考，同時為食品、醫(yī)藥和皮革等工業(yè)提供了新型的米曲酸性蛋白酶來源。