李陽麗，楊小雨，鄧子新，朱冬青

武漢大學(xué) 藥學(xué)院 組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071

1899年，德國化學(xué)家阿道夫· 馮· 拜耳和他的學(xué)生維克多· 維立格報(bào)道了用卡洛酸作為氧化劑，催化環(huán)酮生成相應(yīng)內(nèi)酯的反應(yīng)，即有機(jī)化學(xué)中著名的拜耳-維立格 (Baeyer-Villiger，BV) 氧化反應(yīng)。反應(yīng)機(jī)理如圖1所示，過氧酸親核進(jìn)攻羰基碳形成Criegee中間體，連接處兩個(gè)碳中的一個(gè)遷移到氧上形成酯，同時(shí)釋放一分子羧酸[1]。用過酸催化BV反應(yīng)雖然成本相對(duì)較低，但在底物選擇性、反應(yīng)的區(qū)域選擇性和立體選擇性等方面并不能滿足有機(jī)合成的需求，同時(shí)過酸的使用會(huì)引起生產(chǎn)過程中的安全隱患、廢棄物處理以及環(huán)境污染等諸多問題。這些有機(jī)催化BV反應(yīng)的缺點(diǎn)在下文將要提到的生物催化BV反應(yīng)中是不存在的。

圖1 拜耳-維立格氧化反應(yīng)Fig.1 Baeyer-Villiger oxidations.

1948年就已經(jīng)有報(bào)道微生物可以催化BV反應(yīng)[1]。1976年催化BV反應(yīng)的拜耳-維立格單加氧酶(BVMO)第一次被分離純化[2–3]。1988年第一個(gè)編碼BVMO的基因從不動(dòng)桿菌中被克隆[4]，隨后參與碳源分解代謝的環(huán)戊酮單加氧酶 (CPMO)、環(huán)己酮單加氧酶 (CHMO)、苯基丙酮單加氧酶(PAMO) 等BVMO對(duì)應(yīng)的基因陸續(xù)從各種微生物中被克隆并深入研究。目前所發(fā)現(xiàn)的BVMO都屬于黃素依賴的單加氧酶，可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和O型三類。Ⅰ型BVMO以FAD和NADPH為輔助因子，蛋白序列上具有一個(gè)保守的motif(FXGXXXHXXXWP)，大部分BVMO屬于這一類型；Ⅱ型BVMO以FMN和NAD(P)H為輔助因子，沒有Ⅰ型BVMO所具有的保守motif，此類型相對(duì)較少；O型BVMO雖然需要FAD和NAD(P)H作為輔助因子，但是蛋白序列上不具備Ⅰ型BVMO的保守motif。

與過酸催化BV反應(yīng)相比，BVMO在催化BV反應(yīng)中表現(xiàn)出了高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性，同時(shí)反應(yīng)條件非常溫和。分解代謝中的BVMO具有較廣的底物選擇范圍，在有機(jī)合成領(lǐng)域具有更大的應(yīng)用潛力，因此被深入研究和改造。已有不少文獻(xiàn)對(duì)BVMO的研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)的整理，同樣偏重于分解代謝中BVMO的相關(guān)工作[5-9]。本文僅僅針對(duì)微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成中的BVMO研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中的BV反應(yīng)

依據(jù)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)所具有的保守結(jié)構(gòu)域，將微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成代謝途徑中的BVMO分為以下4類：第1類具有CzcO結(jié)構(gòu)域(NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫記錄號(hào)COG2072，下同)，即Ⅰ型BVMO；第2類具有SsuD結(jié)構(gòu)域(COG2141)，即Ⅱ型BVMO；第3類具有UbiH結(jié)構(gòu)域 (COG0654)，即O型BVMO；第4類為具有ABM結(jié)構(gòu)域(Pfam: PF03992)的BVMO。

1.1 具有CzcO結(jié)構(gòu)域的BVMO

1.1.1 戊丙酯菌素生物合成途徑中的PtlE、PntE和PenE

戊丙酯菌素Pentalenolactone是鏈霉菌產(chǎn)生的倍半萜類抗生素。隨著重要農(nóng)用抗生素阿維菌素的產(chǎn)生菌阿維鏈霉菌基因組的測(cè)序完成，與戊丙酯菌素合成相關(guān)的基因簇被發(fā)現(xiàn)，即ptl基因簇。2009年美國布朗大學(xué)David E.Cane教授課題組確定了此基因簇中的BVMO基因ptlE所編碼的蛋白催化1-deoxy-11-oxopentalenic acid生成新戊丙酯菌素D[10](圖2A)。而脫葉鏈霉菌戊丙酯菌素生物合成基因簇pen中同源基因penE和沙場鏈霉菌戊丙酯菌素生物合成基因簇pnt中同源基因pntE所編碼的酶催化BV反應(yīng)生成的產(chǎn)物則是戊丙酯菌素D，與PtlE相比表現(xiàn)出相反的區(qū)域選擇性[11]。

針對(duì)這一組同源蛋白進(jìn)行點(diǎn)突變，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示PntE的185位亮氨酸突變成PtlE相應(yīng)位置的絲氨酸后產(chǎn)生的突變體蛋白PntE (L185S) 催化生成新戊丙酯菌素D，即與PtlE催化生成的產(chǎn)物相同[12]。說明此位置對(duì)這一組同源的BVMO在催化反應(yīng)過程中的區(qū)域選擇性有至關(guān)重要的作用。

1.1.2 細(xì)胞松弛素生物合成途徑中的CcsB

細(xì)胞松弛素Cytochalasin是真菌產(chǎn)生的具有抗血管增生活性的次生代謝產(chǎn)物。2011年美國唐奕教授課題組在棒曲霉中克隆并確定了大約30 kb細(xì)胞松弛素的生物合成基因簇，其中包括一個(gè)BVMO基因ccsB[13]。深入研究證明CcsB首先以Ketocytochalasin為底物，發(fā)生第一次氧的插入，生成Precytochalasin，緊接著以Precytochalasin為底物發(fā)生第二次氧的插入，生成Cytochalasin Z16，如圖2B所示[14]。

1.1.3 3,5-二甲基苔色酸衍生的雜萜類化合物生物合成途徑中的AusC、PrhK和AndJ

3,5-二甲基苔色酸衍生的雜萜類化合物是由真菌合成的一類天然產(chǎn)物。構(gòu)巢曲霉產(chǎn)生的Austinol和Dehydroaustinol屬于這類化合物，其生物合成基因簇于2012年確定[15]，基因簇中的ausB基因所編碼的具有CzcO結(jié)構(gòu)域的蛋白被認(rèn)為催化了生物合成途徑中的一步BV反應(yīng)[15]。但是緊接下來的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推翻了這個(gè)結(jié)論，基因簇中另一個(gè)同源基因ausC所編碼的蛋白才是真正負(fù)責(zé)此反應(yīng)的BVMO[16]，如圖2C所示。

青霉菌來源的同源蛋白PrhK和變色曲霉來源的同源蛋白AndJ分別在Paraherquonin和Anditomin生物合成途徑中被認(rèn)為催化一樣或者類似的反應(yīng)[17]。

1.1.4 毒隱翅蟲素生物合成途徑中的PedG

毒隱翅蟲共生菌能夠產(chǎn)生毒隱翅蟲素Pederin。2002年其生物合成基因簇被確定，其中含有一個(gè)BVMO基因pedG[18-19]。研究者對(duì)PedG如何參與毒隱翅蟲素的生物合成給出了兩種推測(cè) (圖2D)：途徑a，PedF最后一個(gè)模塊的ACP結(jié)構(gòu)域上連接的中間產(chǎn)物直接被PedG催化生成酯，緊接著水解生成毒隱翅蟲素的主體結(jié)構(gòu)；途徑b，PedF催化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物繼續(xù)被PedH延伸和釋放，生成Onnamide類型的中間體，在PedG催化下生成酯，然后水解生成毒隱翅蟲素的主體結(jié)構(gòu)。

1.1.5 異呋喃萘醌類化合物生物合成途徑中的IfnQ和IfqQ

異呋喃萘醌類化合物是植物、真菌和放線菌產(chǎn)生的具有抗氧化和抗瘧原蟲活性的天然產(chǎn)物[20]。2016年在鏈霉菌RI-77中確定了第一個(gè)此類化合物的生物合成基因簇[21]。JBIR-76和77是鏈霉菌RI-77中一個(gè)Ⅱ型聚酮合酶基因簇ifn負(fù)責(zé)產(chǎn)生的異呋喃萘醌類化合物[22]，終產(chǎn)物并沒有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，但是基因簇中包含一個(gè)BVMO基因ifnQ，暗示著生物合成途徑中可能涉及到BV反應(yīng)和含有內(nèi)酯的中間產(chǎn)物。ifnQ基因敲除和IfnQ的生化反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其可能負(fù)責(zé)二環(huán)中間體上支鏈的成酯反應(yīng)，如圖2E所示，以便后期支鏈上碳鏈的縮短和第3個(gè)環(huán)的形成[21]。

2017年美國沈奔教授課題組在鏈霉菌CB01883中同樣分離到此類化合物，確定了相關(guān)的生物合成基因簇ifq，與ifn基因簇同源[23]。其中IfqQ被認(rèn)為負(fù)責(zé)與其同源蛋白IfnQ相同的反應(yīng)。

1.2 具有SsuD結(jié)構(gòu)域的BVMO

潮霉素屬于萘醌類安莎霉素，山東大學(xué)沈月毛教授課題組于2014年從鏈霉菌中克隆了潮霉素生物合成基因簇。其中hgc3基因編碼的蛋白屬于LLM家族FMN依賴的單加氧酶。依據(jù)基因hgc3敲除實(shí)驗(yàn)可以推測(cè)Hgc3可能以prohygrocin為底物，催化BV反應(yīng)生成17-dehydroxyhygrocin(圖3)[24]。

1.3 具有UbiH結(jié)構(gòu)域的BVMO

1.3.1 光輝霉素生物合成途徑中的MtmOIV和CmmOIV

臨床抗癌藥物光輝霉素生物合成途徑中的MtmOIV是第一個(gè)被研究的已知天然底物的BVMO。光輝霉素由鏈霉菌產(chǎn)生，1996年其生物合成基因簇被克隆[25]，隨后生物合成途徑被逐步研究[26–27]。光輝霉素的三環(huán)核心結(jié)構(gòu)對(duì)活性來講是必需的，因此生物合成過程中中間體前光輝霉素B上第4個(gè)環(huán)的清除顯得尤為重要。mtmOIV編碼的單加氧酶能夠催化前光輝霉素B第4個(gè)環(huán)形成前光輝霉素B內(nèi)酯，然后水解開環(huán)和脫羧生成光輝霉素DK[28–30]，如圖4A所示。通過對(duì)MtmOIV蛋白三維結(jié)構(gòu)的深入分析，逐步確認(rèn)了其FAD的結(jié)合位點(diǎn)、底物的結(jié)合位點(diǎn)，以及部分NADPH的結(jié)合位點(diǎn)[31–33]。

圖2 微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中具有CzcO結(jié)構(gòu)域的單加氧酶催化的拜耳-維立格反應(yīng)Fig.2 Baeyer-Villiger recations catalysed by BVMOs with CzcO domain in the biosynthesis of microbial secondary metabolites.(A) Pentalenolactone.(B) Cytochalasin.(C) Austinol and anditomin.(D) Pederin.(E) JBIR-76 and JBIR-77.

圖3 微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中具有SsuD結(jié)構(gòu)域的單加氧酶催化的拜耳-維立格反應(yīng)Fig.3 Baeyer-Villiger recation catalysed by BVMOs with SsuD domain in the biosynthesis of microbial secondary metabolites.

與光輝霉素同一類型的化合物Chromomycin的生物合成基因簇中cmmOIV與mtmOIV同源，被認(rèn)為催化相同的反應(yīng)[34]。

1.3.2 苯并夾氧雜蒽類抗生素FD-594生物合成途徑中的PnxO4

FD-594是鏈霉菌產(chǎn)生的具有抗腫瘤和抗菌活性的化合物，2011年其基因簇被克隆[35]，推測(cè)其中含有一個(gè)FAD依賴的單加氧酶基因pnxO4所編碼的酶催化BV反應(yīng)產(chǎn)生內(nèi)酯中間體，如圖4B所示。緊接著內(nèi)酯水解、旋轉(zhuǎn)、重新環(huán)化，環(huán)氧鍵打開，脫羧生成雙鍵。

1.3.3 角環(huán)素類抗生素BE-7585A生物合成途徑中的BexE和BexM

角環(huán)素類化合物是一組由Ⅱ型聚酮合酶合成的天然產(chǎn)物。BE-7585A是從東方擬無枝酸菌中分離得到，具有抗癌活性[36]。基因簇中的兩個(gè)基因bexE和bexM所編碼的兩個(gè)FAD依賴的酶被認(rèn)為參與BV反應(yīng)，如圖4C所示，其中BexE實(shí)現(xiàn)蒽環(huán)類骨架轉(zhuǎn)角形成角環(huán)素類骨架[37]。而BexM則可能以BexE催化的產(chǎn)物為底物，通過BV反應(yīng)產(chǎn)生內(nèi)酯中間物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)遷移碳的羥化。

1.3.4 9,10-菲醌結(jié)構(gòu)生物合成途徑中的MrqO6

Murayaquinone是鏈霉菌產(chǎn)生的含有9,10-菲醌核心結(jié)構(gòu)的化合物。與角環(huán)素類骨架形成類似，9,10-菲醌中所具有的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)也是BVMO參與形成的。2017年上海交通大學(xué)的陶美鳳教授課題組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在3個(gè)氧化還原酶的催化下，線性的蒽烯發(fā)生氧化重排生成了具有轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的9,10-菲醌[38]，這其中處于中心的位置是催化BV反應(yīng)的MrqO6，如圖4D所示。

1.3.5 呋喃酮類化合物生物合成途徑中的Orf8_E837、Orf13_E492和AufJ

E-837、E-492和E-975是鏈霉菌中的Ⅰ型聚酮合酶催化合成的含有呋喃酮結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物[39]。兩個(gè)生物合成基因簇分別含有一個(gè)BV單加氧酶基因orf8_E837和orf13_E492。研究者認(rèn)為聚酮合酶合成的碳鏈經(jīng)過環(huán)化和釋放形成六元環(huán)，羥化后的中間物在Orf8_E837或者Orf13_E492催化下發(fā)生BV反應(yīng)，如圖4E所示。緊接著開環(huán)脫羧，在其他酶催化下重新環(huán)化生成呋喃酮。

Aurafuron是從粘細(xì)菌中分離到的化合物[40]。2007年在橙色標(biāo)樁粘細(xì)菌中克隆了生物合成基因簇，其中含有一個(gè)FAD依賴的單加氧酶基因aufJ[41]。研究者認(rèn)為AufJ參與呋喃酮的形成，但與Orf8_E837和Orf13_E492不同，AufJ催化AufC最后一個(gè)模塊的ACP結(jié)構(gòu)域上連接的中間產(chǎn)物生成酯，水解釋放出縮短了碳鏈的中間產(chǎn)物，然后環(huán)化生成呋喃酮。此推測(cè)的途徑與毒隱翅蟲素生物合成中PedG催化的反應(yīng)途徑a類似。

1.3.6 吡咯里西啶生物堿生物合成途徑中的PxaB和LgnC

吡咯里西啶生物堿是兩個(gè)五元環(huán)形成的含氮雜環(huán)化合物，一般由植物產(chǎn)生，用于抵抗植食性昆蟲。2015年武漢大學(xué)虞沂教授課題組從鏈霉菌中克隆了Legonmycin的生物合成基因簇[42]?；虼刂械幕騦gnC編碼的FAD依賴的氧化還原酶以吲哚里西啶中間物為底物，首先催化BV反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)環(huán)，隨后水解、脫羧和重新環(huán)化，生成吡咯里西啶骨架結(jié)構(gòu)，如圖4F所示。LgnC有可能催化隨后羥化反應(yīng)。與此同時(shí)德國Bode教授課題組從致病桿菌中克隆了Pyrrolizixenamide的生物合成基因簇[43]?；虼刂衟xaB基因編碼的蛋白催化與LgnC類似的反應(yīng)，如圖4G所示，不做贅述。

1.3.7 Lipocyclocarbamate生物合成途徑中的LpiC和BraC

與吡咯里西啶生物堿類似，Lipocyclocarbamate(LCC) 是一組具有吡咯并噁唑骨架結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物。2013年和2014年在熒光假單胞菌中克隆確定了這類化合物的生物合成基因簇[44–45]。兩個(gè)基因簇中的同源基因lpiC和braC編碼的蛋白不管是識(shí)別的底物還是催化的反應(yīng)都與PxaB和LgnC非常類似 (圖4F、4G)。

圖4 微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中具有UbiH結(jié)構(gòu)域的單加氧酶催化的拜耳-維立格反應(yīng)Fig.4 Baeyer-Villiger recations catalysed by BVMOs with UbiH domain in the biosynthesis of microbial secondary metabolites.(A) Mithramycin.(B) FD-594.(C) BE-7585A.(D) Murayaquinone.(E) E-837, E-492 and aurafuron.(F)Legonmycin.(G) Pyrrolizixenamide and lipocyclocarbamate.

1.4 具有ABM結(jié)構(gòu)域的BVMO

新角蒽環(huán)類抗生素是一組由Ⅱ型PKS合成的具有新角蒽環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，其中也包含了一些骨架結(jié)構(gòu)在新角蒽環(huán)基礎(chǔ)上發(fā)生了明顯改變的化合物，例如Kinamycin、Jadomycin和Gilvocarcin。這些改變都與氧化還原酶參與的BV反應(yīng)相關(guān)。2012年和2015年，中國科學(xué)院微生物研究所楊克遷教授課題組針對(duì)Jadomycin和Kinamycin生物合成途徑中兩個(gè)同源蛋白JadG和AlpJ(以及KinG)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)JadG和AlpJ負(fù)責(zé)新角蒽環(huán)骨架中B環(huán)的開環(huán)[46–47]，2017年AlpJ的蛋白結(jié)構(gòu)被解析[48]。在Gilvocarcin生物合成途徑中的同源蛋白GilOII的研究過程中，一個(gè)含內(nèi)酯的中間產(chǎn)物被分離和確定，如圖5所示，證明了B環(huán)的開環(huán)與BV反應(yīng)有關(guān)[49]。與之同源的并且可能催化類似反應(yīng)的還包括Lomaiviticin生物合成途徑中的Lom28 (以及Strop_2200)[50–51]、Fluostatin生物合成途徑中的FlsG (以及Flu_orf17)[52–53]、Chrysomycin生物合成途徑中的ChryOII、Ravidomycin生物合成途徑中的RavOII[54]。

圖5 微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中具有ABM結(jié)構(gòu)域的單加氧酶催化的拜耳-維立格反應(yīng)Fig.5 Baeyer-Villiger recations catalysed by BVMOs with ABM domain in the biosynthesis of microbial secondary metabolites.

2 BV反應(yīng)的特點(diǎn)

針對(duì)分解代謝中涉及的BVMO，研究者往往從生物催化應(yīng)用的角度出發(fā)，選擇各種結(jié)構(gòu)簡單的含酮化合物作為底物，測(cè)定酶的底物選擇性和催化活性，以及反應(yīng)的區(qū)域選擇性和立體選擇性。與分解代謝不同，一般情況下微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中的BVMO都有相對(duì)明確的天然底物，研究工作往往圍繞天然底物展開。以上所列舉的BVMO的天然底物存在巨大的差異，有的BVMO識(shí)別小分子化合物，也有的BVMO可以識(shí)別連接在蛋白 (ACP) 上的化合物。而作為底物的小分子也有明顯的結(jié)構(gòu)多樣性，有相對(duì)簡單的化合物，例如參與戊丙酯菌素生物合成的BVMO所識(shí)別的底物為簡單的三環(huán)化合物 (圖2A)；也有相對(duì)復(fù)雜的化合物，例如參與光輝霉素生物合成的BVMO所識(shí)別的底物為發(fā)生糖基化修飾的稠環(huán)芳烴化合物 (圖3A)。

就反應(yīng)的區(qū)域選擇性來講，以上所列大部分BVMO遵循有機(jī)化學(xué)中BV反應(yīng)區(qū)域選擇性規(guī)律，即含氫少的碳發(fā)生遷移，生成正常的內(nèi)酯，例如戊丙酯菌素生物合成中的PtlE、細(xì)胞松弛素生物合成中的CcsB、3,5-二甲基苔色酸衍生的雜萜類化合物生物合成中的AusC、PrhK和AndJ、潮霉素生物合成中的Hgc3、角環(huán)素類抗生素生物合成中的BexE和BexM、9,10-菲醌結(jié)構(gòu)生物合成中的MrqO6、呋喃酮類化合物生物合成中的AufJ。少數(shù)BVMO并不遵循這一規(guī)律，即含氫多的碳發(fā)生了遷移，生成非正常內(nèi)酯，例如戊丙酯菌素生物合成中的PntE和PenE。就反應(yīng)的立體選擇性來講，戊丙酯菌素生物合成中的PtlE和細(xì)胞松弛素生物合成中的CcsB遵循了有機(jī)化學(xué)中BV反應(yīng)立體選擇性規(guī)律，即遷移的碳如果是手性碳，在遷移后都保留了遷移前的手性。其他BVMO或者不涉及此問題，或者研究者并沒有給出明確的結(jié)論。

有的BVMO的天然底物中連接羰基碳的并不都是碳，例如CcsB第二次的BV反應(yīng)底物 (圖2B)、Orf8_E837或者Orf13_E492的底物 (圖4E)以及LgnC、PxaB、LpiC和BraC的底物 (圖4F，4G)。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明在BVMO在生物催化應(yīng)用中不僅僅可以用來催化酮生成酯，也有可能催化酯類化合物生成碳酸酯類化合物，催化酰胺類化合物生成胺甲酸酯類化合物。

許多BVMO所催化的不僅僅是BV反應(yīng)，往往還伴隨著其他后續(xù)反應(yīng)的發(fā)生，例如水解、脫羧、分子內(nèi)重排、羥化等。對(duì)于酯來說，發(fā)生水解以及脫羧很容易理解。分子內(nèi)重排的典型例子是MrqO6所參與的9,10-菲醌的形成，這可能與內(nèi)酯中間產(chǎn)物本身的結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系。值得注意的是黃素依賴的蛋白催化碳原子或者雜原子的羥化有很多報(bào)道，但是LgnC和PxaB催化BV反應(yīng)的同時(shí)也可以催化碳原子羥化的現(xiàn)象則較為少見。

目前并沒有文獻(xiàn)報(bào)道這些BVMO是否能夠識(shí)別非天然的底物催化BV反應(yīng)或者雜原子的氧化。我們小組在研究戊丙酯菌素生物合成時(shí)發(fā)現(xiàn)PntE能夠以環(huán)戊酮和環(huán)己酮為底物催化BV反應(yīng)生成相應(yīng)的內(nèi)酯，但是相對(duì)于天然底物，PntE對(duì)非天然底物的轉(zhuǎn)化效率非常低 (未發(fā)表)。

3 BVMO蛋白的特點(diǎn)

利用以上列舉的4類BVMO蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6A所示，大部分的蛋白根據(jù)其具有的保守結(jié)構(gòu)域聚成一群。

1.1中列舉的具有CzcO結(jié)構(gòu)域的BVMO，即Ⅰ型BVMO，所催化的天然底物在結(jié)構(gòu)上雖然相差很大，但這一組蛋白的氨基酸序列上依然表現(xiàn)出了相對(duì)較高的一致性和相似性。首先Ⅰ型BVMO具有的保守motif (FXGXXXHXXXWP)，在BVMO都能找到，但略有出入，如圖6B箭頭標(biāo)示位置：第一，大部分蛋白此保守區(qū)域的序列是FXGXXXHXXXWD，即最后一個(gè)氨基酸并不是脯氨酸，而是天冬氨酸；第二，AusC、PrhK和AndJ此保守區(qū)域的序列為YXGXXXHXXXWD，即第一個(gè)氨基酸并不是苯丙氨酸，而是酪氨酸；第三，PedG與其他蛋白相比，在一級(jí)序列上的相似性和一致性較低，保守的 motif序列為FXGXXXHXXXYK，即最后兩個(gè)氨基酸不是色氨酸和脯氨酸，而是酪氨酸和賴氨酸?？梢栽斐蒔ntE區(qū)域選擇性發(fā)生超過90%反轉(zhuǎn)的突變L185S就位于此保守motif前15個(gè)氨基酸的位置，如圖6B左邊三角標(biāo)示位置。而另外一個(gè)對(duì)PntE區(qū)域選擇性產(chǎn)生大約30%反轉(zhuǎn)的突變是R484L，如圖6B右邊三角標(biāo)示位置。氨基酸序列同源比對(duì)表明此突變所在的區(qū)域是通過蛋白質(zhì)工程對(duì)PAMO的區(qū)域選擇性和立體選擇性進(jìn)行改造的重點(diǎn)區(qū)域。

與Ⅰ型BVMO相比，已發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型BVMO并不多，研究深入的例子是假單胞菌中參與樟腦烷分解代謝的兩個(gè)二酮樟腦烷單加氧酶：2,5-二酮樟腦烷-1,2-單加氧酶 (2,5-DKMO)和3,6-二酮樟腦烷-1,6-單加氧酶 (3,6-DKMO)。3,6-DKMO是唯一的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被解析的Ⅱ型BVMO。但通過序列的同源比對(duì)，可以發(fā)現(xiàn)3,6-DKMO活性中心與FMN結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基在2,5-DKMO中沒有表現(xiàn)出保守性。氨基酸水平的序列比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)3,6-DKMO活性中心與FMN結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基在Hgc3中同樣沒有表現(xiàn)出保守性，系統(tǒng)發(fā)育樹中Hgc3也沒有與3,6-DKMO和2,5-DKMO聚成一群。依據(jù)Hgc3蛋白具有SscD結(jié)構(gòu)域和對(duì)hgc3基因敲除突變株的檢測(cè)結(jié)果推測(cè)其催化BV反應(yīng)是有其合理性的，但是缺乏可作為直接證據(jù)的體外生化反應(yīng)，使得此結(jié)論的得出尚存疑慮。

與1.1所列舉的Ⅰ型BVMO相比，1.3列舉的O型BVMO在蛋白的氨基酸序列水平上的一致性和相似性明顯降低。其中MtmOIV蛋白的三維結(jié)構(gòu)被深入研究：MtmOIV有FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基10–183和276–394組成)、中間結(jié)構(gòu)域 (氨基酸殘基184–275)和C端結(jié)構(gòu)域 (氨基酸殘基395–510) 3個(gè)結(jié)構(gòu)域。O型BVMO蛋白序列上并不具備Ⅰ型BVMO所具有的保守motif序列，但從序列比對(duì)的結(jié)果可以看到保守的區(qū)域主要有3個(gè) (以MtmOIV為例說明所處位置)，如圖6C所示：第一，MtmOIV的15–42氨基酸區(qū)域；第二，MtmOIV的159–182氨基酸區(qū)域；第三，MtmOIV的285–320氨基酸區(qū)域，即UbiH結(jié)構(gòu)域。這3個(gè)氨基酸序列保守的區(qū)域均位于MtmOIV的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域。蛋白C端 (即MtmOIV的477–485氨基酸區(qū)域) 也存在一定的保守性。

到目前為止，具有合成代謝途徑中具有ABM結(jié)構(gòu)域的BVMO在分解代謝途徑中未見報(bào)道，BVMO分類中也并不包括這一類。系統(tǒng)發(fā)育樹暗示這一類BVMO在進(jìn)化關(guān)系上可能與具有SsuD結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型BVMO相對(duì)較近。此類BVMO僅有不到250個(gè)氨基酸殘基，明顯小于其他三類。另外，此類BVMO雖然在催化反應(yīng)時(shí)也需要FAD或者FMN參與，但蛋白本身與這些輔因子并沒有很強(qiáng)的結(jié)合能力。已發(fā)現(xiàn)的這類蛋白的催化底物基本一致，所以其在氨基酸序列上具有較高的一致性和相似性。依據(jù)已被解析的AlpJ的三維結(jié)構(gòu)，Asn60、Trp64和Trp181被認(rèn)為可能與底物結(jié)合相關(guān)，His50和Tyr178被認(rèn)為可能和三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定相關(guān)[48]。在其他同源蛋白中，這5個(gè)氨基酸殘基表現(xiàn)出高度的保守性。

需要注意的是當(dāng)對(duì)某一個(gè)酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)其具有以上4種保守結(jié)構(gòu)域中某一種，這并不能說明其必然催化BV反應(yīng)。例如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鳳權(quán)教授課題組所報(bào)道的吩嗪類抗生素生物合成途徑中的LaPhzNO1，其具有CzcO保守結(jié)構(gòu)域，但催化N的氧化，并非BV反應(yīng)[55]。

4 小結(jié)

限制酶催化和生物催化在有機(jī)合成中應(yīng)用的因素有很多，其中最重要的有兩點(diǎn)：第一，酶作為蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的；第二，酶一般具有較窄的底物選擇范圍。一直以來微生物分解代謝中的CHMO和PAMO因其相對(duì)較寬的底物選擇范圍或相對(duì)較高的熱穩(wěn)定性而成為研究和改造的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象，例如通過蛋白質(zhì)工程等手段拓寬底物范圍，改變區(qū)域選擇性，改善對(duì)映選擇性，提高對(duì)硫的氧化能力，改變其輔因子，增加穩(wěn)定性等[5–9]。從2002年開始出現(xiàn)利用BVMO實(shí)現(xiàn)公斤級(jí)以上規(guī)模生物催化的零星報(bào)道，也有固定化酶、固定化細(xì)胞、兩相催化體系和大規(guī)模催化中氧的供給等問題的研究[6]。這些研究加深了我們對(duì)BVMO基礎(chǔ)酶學(xué)和生物催化的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也對(duì)其工業(yè)應(yīng)用作出了有力的推動(dòng)。

微生物次生代謝產(chǎn)物是藥物的重要來源之一，關(guān)注天然產(chǎn)物生物合成的課題組往往把研究重心放在生物合成基因簇的克隆，生物合成途徑的推測(cè)和驗(yàn)證，酶催化機(jī)制的探索，在此基礎(chǔ)上通過合成生物學(xué)手段獲取新的活性化合物。其中相關(guān)酶在生物催化領(lǐng)域的潛在應(yīng)用一般并不作為研究重點(diǎn)。文中針對(duì)這一點(diǎn)，總結(jié)了微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中所涉及的BV反應(yīng)以及負(fù)責(zé)催化BV反應(yīng)的酶，初步分析了反應(yīng)的特點(diǎn)和相關(guān)酶在氨基酸序列上的保守性。希望通過以上總結(jié)和分析能夠?yàn)锽VMO的蛋白質(zhì)工程改造提供更多的選擇，推動(dòng)其在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用。