盧義 張文財 萬雷 黃宏興

1. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是常見的骨代謝性疾病，主要特點為單位體積內(nèi)骨量減少，皮質(zhì)骨變薄，海綿骨骨小梁數(shù)目及大小均減少，骨髓腔增寬，骨骼載荷能力減弱。隨著年齡的增加，發(fā)生骨折的風險也相應增加。到2017年末，我國60歲以上的人口為2.4億，占總?cè)丝?7%。老齡人口還在以每年800萬人的速度增加，預計至2050年，老齡人口將達到總?cè)丝诘?/3[1]。Wnt信號通路是與骨代謝關(guān)系密切的一個重要信號通路，它與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。Dickkopf相關(guān)蛋白1(dickkopf related protein 1，DKK1)是Wnt信號通路的抑制因子，在骨形成過程中起重要作用，被視為骨質(zhì)疏松、骨修復的治療靶點[2]。本課題組在前期研究了骨康方干預過表達DKK1骨細胞的影響，結(jié)果顯示骨康方含藥血清可以提高細胞活性,提高BMP2的相對表達量，有利于成骨細胞的礦化，尤其在過表達DKK1干預后[3]。但骨康方對過表達DKK1生物體的效果如何還未見報道，本研究將從Wnt信號通路的方向，研究其對過表達DKK1大鼠骨形成的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取3月齡SPF級雌性SD大鼠18只，體重(245±25)g，均購于廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心(合格證：SCXK(粵)2013-0034)。飼養(yǎng)于室溫24～28 ℃, 相對濕度為55%～65%,自由攝食水，每天照明12 h, 黑暗12 h。對動物的整個處置過程符合科技部《關(guān)于善待動物的指導性意見》要求。骨康方(熟地黃10 g、淫陽藿 10 g、大棗10 g、肉蓯蓉10 g、丹參 10 g、當歸10 g、補骨脂 10 g、菟絲子 10 g、白芍 10 g、黃芪 10 g)由廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院提供并制成水煮液(1.43 g /mL生藥)。

1.2 儀器和試劑

Trizol (Thermo公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takara 公司)，Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(Takara 公司)，Microseal B seal、Hard-Shell PCR Plate3 96-Well(Takara 公司)，Primescript RT Master Mix(Takara 公司)，異丙醇(廣州化學試劑廠)，氯仿(廣州化學試劑廠)，超凈操作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，水合氯醛(廣州化學試劑廠)，TC-3 K 電子天平(深圳市華恒科技有限公司)，隔離獨立空氣換氣系統(tǒng)IVC(馮氏實驗動物設(shè)備有限公司)，掃描儀[MICROTEK (Bio-5000)]，高速冷凍離心機(Sigma)，PCR儀(Bio-Rad)，漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器)，CFx96 TouchTM Real Time PCR Detection(Bio-Rad)，T100 Themal Cycler(Bio-Rad)，NanoDrop ND-2 000分光光度計(NanoDron Technologies)，Hologic discovery A骨密度儀(Hologic,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1大鼠分組及腺病毒轉(zhuǎn)染：將大鼠隨機分為A 空白對照組(NC)，B 空載腺病毒組(Ad-EV)，C 過表達DKK1腺病毒感染組(Ad-DKK1)，每組6只,用苦味酸標為1～6號；分別用空載腺病毒(Ad-EV)和重組腺病毒(Ad-DKK1)感染B組、C組，腺病毒構(gòu)建方法參考前期研究基礎(chǔ)[4]。病毒液解凍后，吸取1 260 μL的0.9%無菌生理鹽水至各組滴度為1011包裝好的病毒液中，使之成為滴度為1010的病毒液；用一次性1 mL注射器吸取200 μL病毒液，通過腹腔注射轉(zhuǎn)染大鼠。過表達DKK1腺病毒轉(zhuǎn)染組腹腔注射過表達DKK1腺病毒，空載腺病毒組腹腔注射空載腺病毒，空白對照組注射相同體積的生理鹽水。1周后對大鼠進行眼眶采血，PCR驗證腺病毒轉(zhuǎn)染成功。腺病毒轉(zhuǎn)染1個月后[5]開始中藥干預，灌胃給藥容積為10 mL/kg，每組1～3號按4.8 g/kg灌胃中藥[6]，4～6號灌等體積生理鹽水，所用藥物以蒸餾水定容至所需濃度，每天灌胃2次，間隔5 h，連續(xù)灌胃2個月。

1.3.2取材及測定骨密度：中藥灌胃2個月后，水合氯醛麻醉，頸椎脫臼處死。取大鼠股骨，左側(cè)股骨浸入4%多聚甲醛液中固定，右側(cè)股骨放置無菌凍存管，液氮凍存?zhèn)溆?。將浸在甲醛中的股骨用Hologic discovery A骨密度儀及儀器自帶動物軟件測定骨密度，使用軟件中“局部放大”功能測定股骨骨密度，誤差系數(shù)(CV值)：1%。液氮中的股骨提取RNA后PCR驗證。

1.3.3RT-PCR 檢測：參照美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布的cDNA設(shè)計上下游引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成?？俁NA提取：液氮中取出股骨，取松質(zhì)骨50 mg，液氮研磨至粉狀，TRIZOL法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 反應液的配制：SYBR? Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)7.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA 2.0 μL，dH2O 4.5 μL，PCR反應：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。采用 2-△△Ct法統(tǒng)計分析?！鰿t=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因， △△Ct=△Ct待測樣品中目的基因-△Ct對照樣品中目的基因，相對樣品模板量=2-△△Ct。引物序列見表1。

圖1 骨康方對DKK1、ACTIN表達影響Fig.1 Effect of Gukang recipe on DKK1 and ACTIN

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P<0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后大鼠血液中DKK1表達量

結(jié)果顯示，Ad-DKK1組DKK1表達量明顯高于NC組(P<0.05)和Ad-EV組(P<0.05)，腺病毒轉(zhuǎn)染成功，見表2。

表 2 大鼠血液DKK1表達量Table 2 DKK1 expression in rat blood

注:與NC組比較，#P<0.05; 與Ad-EV組比較，*P<0.05。

2.2 各組大鼠股骨BMD變化

結(jié)果顯示，過表達DKK1組(Ad-DKK1)股骨BMD均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)；在NC組、Ad-EV組、Ad-DKK1組內(nèi)，骨康方灌胃大鼠BMD均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；空白對照組(NC)和空載腺病毒組(Ad-EV)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表 3 大鼠BMD分析(g/cm2)Table 3 Analysis of BMD in each group (g/cm2)

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

2.3 骨康方對大鼠Wnt通路相關(guān)因子的影響

結(jié)果顯示在各組內(nèi)，骨康方灌胃大鼠APC mRNA 相對表達量均低于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組APC mRNA 相對表達量均高于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。見表4～表8。

表 4 APC mRNA 相對表達量Table 4 Relative expression APC mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

圖2 骨康方對APC mRNA表達影響Fig.2 Effect of Gukang recipe on APC mRNA

圖3 骨康方對LRP6表達影響Fig.3 Effect of Gukang recipe on LRP6

由表5可見，在各組內(nèi)，灌胃骨康方大鼠LRP6 mRNA相對表達量均高于灌胃生理鹽水(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組LRP6 mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

由表6可見，在各組內(nèi)，骨康方灌胃大鼠β-catenin mRNA相對表達量均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組β-catenin mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

表 5 LRP6 mRNA 相對表達量Table 5 Relative expression LRP6 mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

表 6 β-catenin mRNA 相對表達量Table 6 Relative expression β-catenin mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

由表7可見，在各組內(nèi)，骨康方灌胃大鼠RUNX2 mRNA相對表達量均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組RUNX2 mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

圖4 骨康方對β-catenin表達影響Fig.4 Effect of Gukang recipe on β-catenin

表 7 RUNX2 mRNA 相對表達量Table 7 Relative expression RUNX2 mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

由表8可見，在各組內(nèi)，骨康方灌胃大鼠OPG mRNA相對表達量均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組OPG mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

圖5 骨康方對RUNX2表達影響Fig.5 Effect of Gukang recipe on RUNX2

表8 OPG mRNA 相對表達量Table 8 Relative expression OPG mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

圖6 骨康方對OPG表達影響Fig.6 Effect of Gukang recipe on OPG

2.4 骨康方對DKK1、OPG蛋白的影響

由Western blot結(jié)果可見：①過表達DKK1抑制OPG表達；②與灌胃生理鹽水比較，灌胃骨康抑制DKK1蛋白表達，促進OPG蛋白表達。

圖7 骨康方對DKK1、OPG蛋白的影響注：NC:空白對照組。Ad-EV：空載腺病毒組。Ad-DKK1:過表達DKK1組。GK:骨康。NS：生理鹽水。Fig.7 Effect of Gukang recipe on DKK1 and OPG protein

3 討論

中醫(yī)對骨質(zhì)疏松癥有著獨到的見解，骨質(zhì)疏松在中醫(yī)屬“骨痿”。中醫(yī)認為骨痿與腎、脾、肝、血瘀密切相關(guān)。骨康方以補骨脂為君藥，熟地、淫羊藿、白芍為臣藥，共奏補腎壯骨、滋陰益精之效。有學者[7]認為腎精與骨髓間充質(zhì)干細胞在來源、功能上有許多相似性, 骨髓間充質(zhì)干細胞及其功能是腎精在細胞水平上的表現(xiàn)形式，腎精虧虛導致的骨質(zhì)疏松癥必定影響到骨髓間充質(zhì)干細胞及其功能，而補腎中藥具有干預骨髓間充質(zhì)干細胞的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學[8]已經(jīng)證實補腎中藥可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞增殖分化。曹大林等[9]研究后認為，補骨脂能夠明顯提高骨密度，上調(diào)β-catenin蛋白表達,激活Wnt信號通路。脾主四肢，為后天之本，氣血生化之源，脾虛是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要因素。正如朱丹溪[10]所述：“大抵脾胃虛弱，陽氣不能生長……則骨乏無力，令人骨髓空虛，足不能履地”。所以治骨痿，健脾是關(guān)鍵，骨康方配以黃芪補脾益氣。歐莉等[11]研究后認為，熟地配伍黃芪能激活Wnt/LRP/β-catenin信號通路，降低破骨細胞活性，促進成骨細胞生成,達到調(diào)節(jié)骨代謝的目的。人體的氣和血周流于全身，是臟腑經(jīng)絡包括骨骼等一切組織器官進行生理活動的物質(zhì)基礎(chǔ)?！鹅`樞·本臟》中描述道：“氣滯不行，營運無力……筋骨失養(yǎng)。”骨康方以當歸、丹參活血通絡，達到補中寓通、補而不滯的目的。楊亞軍[12]認為，丹參素能直接上調(diào)經(jīng)典Wnt/β-catenin/Tcf信號通路，或者通過抑制FoxO3a信號通路間接促進Wnt通路的激活，從而調(diào)控成骨分化功能,發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

骨康方對治療脾腎陽虛型、肝腎陰虛型、氣滯血瘀型骨痿有很好的療效[13-14]，但是其具體的作用機制還有待進一步研究。王凡[15]的研究表明，骨康方含藥血清可以提高細胞活性，降低鈣離子濃度，抑制細胞的凋亡，有利于成骨細胞礦化，尤其在過表達DKK-1干預后。本課題組前期在細胞水平方面研究了骨康方對過表達DKK1骨細胞的影響，本研究基于Wnt信號通路研究骨康方在過表達DKK1生物體內(nèi)的影響。結(jié)果顯示過表達DKK1會抑制Wnt信號通路，Wnt信號通路受體LRP6 mRNA表達量降低，細胞內(nèi)APC含量升高，與Axin、GSK-3β和β-catenin形成復合體，降解β-catenin，使得下游RUNX2和OPG mRNA表達量降低。給予骨康方干預的大鼠較無骨康方干預大鼠骨密度升高，Wnt信號通路抑制因子DKK1、APC表達量降低，Wnt信號通路中LRP6、β-catenin、RUNX2和OPG表達量升高。Wnt/β-catenin信號通路是一條經(jīng)典信號通路，它具有調(diào)控骨的代謝包括成骨細胞的增殖和分化等功能，激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進成骨細胞增殖分化[16]。有實驗[17-18]證明，在骨髓間充質(zhì)干細胞中，Wnt信號在骨質(zhì)疏松癥期間持續(xù)受到抑制。DKK家族是一組分泌型糖蛋白，共有4種：DKK1、DKK2、DKK3 和DKK4[19]。DKK1基因在骨疾病、腫瘤及腎臟、肝臟中發(fā)揮重要作用，同時也是Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑，通過與脂蛋白相關(guān)蛋白受體6(LRP6)形成復合物，使LRP內(nèi)化和降解，以此降低LRP和Wnt配體的結(jié)合率[20-21]。DKK1與LRP6的結(jié)合使細胞內(nèi)糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、腺瘤息肉蛋白(APC)、軸抑制蛋白(Axin)含量升高，并形成降解復合體，降解β-catenin[22]。研究[23]表明，當β-catenin在胞質(zhì)中達到穩(wěn)定水平時，便可進入核內(nèi)，與T細胞因子/淋巴增強因子(t cell factor/lymphoid enhancing factor，TCF/LEF)結(jié)合,調(diào)節(jié)Runx2等骨靶基因的表達，進而促進成骨細胞分化。沒有β-catenin向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移積累，β-catenin就無法通過與 TCF/LEF 結(jié)合，從而促進下游RUNX2、OPG等靶基因的表達[24]。Runx2(runt-related transcription factor 2) 是促進骨形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過調(diào)控成骨細胞特異性細胞外基質(zhì)蛋白基因的表達和成骨細胞周期參與成骨細胞的分化過程，促進骨形成和抑制骨吸收[25]。骨保護素(OPG)是調(diào)節(jié)骨重建過程中破骨細胞功能的重要調(diào)節(jié)因子，OPG可以抑制破骨細胞功能,減少骨質(zhì)破壞[26]。

綜上，過表達DKK1可導致大鼠股骨骨密度降低，骨康方可以通過促進Wnt信號通路中LRP6、β-catenin、RUNX2、OPG基因的表達促進成骨，抑制Wnt信號通路抑制因子DKK1的表達，為骨康方治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的動物實驗依據(jù)，但其起主要作用的成分以及治療骨質(zhì)疏松的其他機制還有待進一步研究。