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        淘米水發(fā)酵物中2種有機酸的測定

        2019-03-27 02:53:52陸小凱劉仙花洪耀強楊海英
        關(guān)鍵詞:淘米水有機酸發(fā)酵液

        杜 剛,陸小凱,劉仙花,洪耀強,楊海英

        (1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點實驗室, 云南 昆明 650500; 2.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,云南 昆明 650500)

        稻谷是我國的主要糧食作物之一,也是世界上第二大農(nóng)作物,我國年產(chǎn)量超過2.0億噸[1].淘米水即洗米后留下的水,主要含有米糠和糊粉層的營養(yǎng)成分,包括蛋白質(zhì)、膳食纖維、淀粉、谷維素、維生素和礦物質(zhì)等多種生物活性成分[2].米糠蛋白具有抗癌活性和保健功能[3],米糠肽是米糠蛋白經(jīng)蛋白酶水解得到的低分子量多肽,具有低過敏性、易溶解特點[4-5].Choi等[6]對米糠進行CO2超臨界萃取,提取物表現(xiàn)出良好的生發(fā)效果,毛囊顯著增多.

        云南傣族人把每天的淘米水放入盆或桶等容器,進行自然發(fā)酵,傳統(tǒng)發(fā)酵淘米水用于洗發(fā),具有去頭屑、潤發(fā)、亮發(fā)和促使頭發(fā)變黑、變粗等作用[7].淘米水自然發(fā)酵過程伴隨pH下降,推測是淘米水在發(fā)酵過程產(chǎn)生了有機酸.目前測定有機酸的主要分析方法有氣相色譜法[8],離子色譜法[9]、離子排斥色譜法[10-11],毛細管電泳[12]和反相高效液相色譜法[13-15].為研究淘米水發(fā)酵過程有機酸的種類,本文采用高效液相色譜法對淘米水發(fā)酵物中的有機酸測定,以逐步揭示傣族用淘米水對頭發(fā)起養(yǎng)護作用的物質(zhì)基礎(chǔ),為傳統(tǒng)發(fā)酵淘米水在日化工業(yè)的開發(fā)提供實驗依據(jù).淘米水發(fā)酵液中有機酸的HPLC分析方法目前尚無報道.

        1 實驗部分

        1.1 實驗材料及試劑

        淘米水為云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣曼那村傳統(tǒng)發(fā)酵2 d的淘米水,傣族香米云南省勐??h傣鄉(xiāng)米廠.

        甲醇為色譜純,F(xiàn)isher公司;哇哈哈純凈水;乙酸、乳酸(純度>99%);NaH2PO4(AR)、磷酸(AR)等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

        1.2 實驗儀器

        Agilent 1200高效液相色譜儀,包括DAD紫外檢測器,Agilent色譜工作站(美國安捷倫公司);LE204E電子天平(瑞士梅特勒托利多);BINDER VD53真空干燥箱(德國賓得);H2-16KR臺式離心機(湖南可成).

        1.3 實驗方法

        1.3.1 樣品溶液的制備

        取20 mL淘米水發(fā)酵液,進行12 000 r/min離心10 min,取上清液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,4 ℃的冰箱冷藏備用.

        1.3.2 標準品的配制

        取經(jīng)40 ℃減壓干燥至恒重的乙酸、乳酸對照品適量,精密稱定,置于100 mL容量瓶中,用超純水溶解并定容,過0.45 μm微孔濾膜后置于4 ℃的冰箱中保存.配制的對照品混合標準溶液每毫升含4.950 mg乳酸、3.144 mg乙酸,乳酸單標溶液質(zhì)量濃度為 17.09 mg/mL,乙酸單標溶液質(zhì)量濃度為 2.005 mg/mL.

        1.3.3 流動相的考察

        為了得到良好的分離效果,依次考察了不同物質(zhì)的量濃度的NaH2PO4磷酸鹽緩沖溶液(0.01、0.02、0.03 mol/L),不同pH值的流動相(2.0、2.3、2.5、2.9、3.5、4.0、4.5、5.0),不同比例甲醇(1%、10%、20%、30%、70%)對色譜分離的影響.從目標化合物分離度、響應(yīng)值、保留時間、峰形各方面進行比較.

        1.3.4 流速的考察

        考察流動相不同流速(0.4、0.6、0.8、1 mL/min)對色譜分離的影響.

        1.3.5 色譜條件

        色譜柱:Agilent Zorbax SB-Aq(4.6 mm×150 mm,5 μm,),流動相:甲醇-20 mmol/L,pH為2.0的NaH2PO4磷酸鹽緩沖溶液(體積比1∶ 99),流速:0.4 mL/min,柱溫:25 ℃,檢測波長:210 nm.

        1.3.6 標準曲線的繪制

        精密吸取4.950 mg/mL乳酸,3.144 mg/mL乙酸的對照品混合溶液1、5、10、20、50 μL,注入HPLC色譜儀,按照“1.3.5”的色譜條件測定,以峰面積(A)為縱坐標,質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標,進行線性回歸,得標準曲線方程.

        1.3.7 穩(wěn)定性考察

        取樣品溶液(1.3.1方法配制),放置0、2、4、8、16、24 h后,精密吸取樣品溶液5 μL注入HPLC色譜儀,按“1.3.5”項下色譜條件測定,得到峰面積A,計算RSD值,考察樣品的穩(wěn)定性.

        1.3.8 精密度考察

        在 “1.3.5”色譜條件下,精密吸取含4.950 mg/mL乳酸、3.144 mg/mL乙酸的對照品混合溶液5 μL, 注入HPLC色譜儀,連續(xù)進樣3次,測定得峰面積A,計算RSD值.

        1.3.9 回收率試驗

        精密量取已知含量的淘米水發(fā)酵液樣品5份,每份2 mL,分別加入17.09 mg/mL乳酸標準溶液0.5,0.8,1,1.2,1.5 mL,2.005 mg/mL乙酸標準溶液0.5,0.8,1,1.2,1.5 mL,按照“1.3.1”項下處理樣品,按“1.3.5”色譜檢測條件進行測定,計算乳酸、乙酸平均回收率.

        1.3.10 樣品測定

        按“1.3.5”項下色譜條件,精密吸取樣品溶液5 μL,采用外標法對淘米水發(fā)酵液樣品中的有機酸含量進行計算.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 流動相的選擇

        在“1.3.3”項下方法,經(jīng)過試驗對比篩選,當(dāng)NaH2PO4緩沖鹽濃度為0.02 mol/L,甲醇-NaH2PO4緩沖鹽體積比例為1∶ 99,流動相pH為2.0時,樣品溶液得到最佳分離效果.

        2.2 流速的選擇

        按“1.3.4”項下方法實驗,發(fā)現(xiàn)流速在0.4 mL/min時保留時間適當(dāng),峰形較好,故選擇流動相流速為0.4 mL/min.

        2.3 標準曲線的繪制

        按“1.3.6”項下方法測定,繪制乳酸標準曲線,見圖1,乳酸回歸方程為y=570.66x+11.252,R2=1,表明乳酸在0.495~24.75 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.繪制乙酸標準曲線,見圖2,乙酸回歸方程為y=1 533.2x-307.72,R2=0.993 2,表明乙酸在0.314 4~15.72 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

        2.4 穩(wěn)定性實驗

        按“1.3.7”項下方法測定峰面積A,計算峰面積的RSD,乳酸峰面積的RSD為0.58%,乙酸峰面積的RSD為2.50%,表明樣品放置24 h穩(wěn)定.

        2.5 精密度實驗

        按“1.3.8”項下方法實驗,測得峰面積A,計算峰面積的RSD值,乳酸的RSD為0.53%,乙酸的RSD為0.46%,表明HPLC儀器的精密度良好.

        2.6 回收率試驗

        按“1.3.9”項下方法實驗,分別計算乳酸、乙酸回收率,乳酸平均回收率為95.12%,RSD為2.17%(n=5);乙酸平均回收率為92.9%,RSD為4.25%(n=5).

        2.7 淘米水發(fā)酵液中有機酸的分析

        按“1.3.10”項下方法,對樣品溶液和標準品溶液進行檢測,確定樣品溶液中含有乳酸①和乙酸②2種有機酸,對照品和樣品溶液的HPLC色譜圖如圖3、圖4所示.淘米水發(fā)酵液中乳酸①含量為8.575 mg/mL,乙酸②含量為1.040 mg/mL.

        3 結(jié)語

        本實驗建立淘米水發(fā)酵樣品中有機酸含量測定的方法,適用于淘米水發(fā)酵液中有機酸的測定.樣品經(jīng)離心、過濾,檢測條件為:色譜柱Agilent Zorbax SB-Aq(5 μm,4.6 mm×150 mm);紫外檢測波長210 nm;流動相(V/V)為1%甲醇-99%的20 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 2.0);流速0.4 mL/min;柱溫25 ℃.

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