余學高 鄧間開 何小洪 陳培松 崔丹荔 黃彬★

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是嚴重的公共衛(wèi)生問題。全球約有20億人曾感染過HBV，其中超過10%為慢性HBV感染者[1]。每年約有80萬人死于HBV感染所致的相關疾病[2]。HBV DNA定量檢測在早期診斷HBV感染、判斷疾病活動性、制定抗病毒治療方案、治療監(jiān)測以及判斷治療終點中均起到重要作用[3]。

近年來亞太肝病研究學會、歐洲肝病研究學會和我國發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南均推薦用高敏檢測方法檢測HBV DNA載量，前兩者發(fā)布的指南明確要求檢測方法的靈敏度應達到10～15 IU/mL[4-5]。而目前國內各單位常用的HBV DNA定量檢測方法的靈敏度在100～1 000 IU/mL之間，不能很好地滿足臨床對慢性乙肝患者管理的要求。因此，應采用高靈敏度的HBV DNA試劑對患者血清/血漿中的HBV DNA進行檢測，以滿足臨床對慢性乙肝治療監(jiān)測和判斷治療終點等的需要。Pre-NAT全自動核酸檢測系統(tǒng)采用磁珠法進行HBV核酸提取、純化，采用轉移磁珠、防倒吸、尿嘧啶N糖基化酶-脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（uracil N glycosylase-deoxyuridine nucleoside triphosphate，UNG-dUTP）等有效防污染措施，結合HBV DNA高敏定量檢測試劑對血清/血漿中的HBV DNA進行定量檢測。本研究對基于Pre-NAT系統(tǒng)的HBV DNA高敏定量檢測試劑盒進行方法學性能驗證與臨床檢測性能評價。

1 材料與方法

1.1 標準品

定值高濃度HBV假病毒顆粒（7.5×1010IU/mL）由美國Perkin Elmer醫(yī)學診斷事業(yè)部上海浩源公司提供。

1.2 臨床樣本

收集2018年5月至7月間在中山大學附屬第一醫(yī)院檢測的HBV DNA高值樣本和陰性樣本，用于制備高/中/低值混合血清。收集慢性乙型肝炎患者血清64份，涵蓋不同的病毒載量范圍。

1.3 儀器與試劑

Pre-NAT全自動核酸提取儀由美國Perkin Elmer公司提供，COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48病毒載量系統(tǒng)購自瑞士羅氏公司，ABI ViiA7型熒光定量PCR儀購自美國Life Technologies公司，低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司；HBV DNA高敏檢測試劑盒由美國Perkin Elmer醫(yī)學診斷事業(yè)部上海浩源公司提供，其說明書聲明的靈敏度為 20 IU/mL，線性范圍為 20～（1.0×109）IU/mL；COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV核酸檢測試劑盒購自瑞士羅氏公司，其說明書聲明的靈敏度為 20 IU/mL，線性范圍為 20～（1.7×108）IU/mL。

1.4 方法

1.4.1 精密度評價

參考 EP15-A2[6]文件。每天重復檢測高（108IU/mL）、中（105IU/mL）、低（103IU/mL）3個水平的混合血清各5次、連續(xù)測5天，由公式①計算批內不精密度（within-run imprecision，sr），由公式②計算室內不精密度（within-laboratory imprecision，s1），并分別與由公式③、公式④計算得出的廠家聲明的批內標準偏差（performance claim repeatability standard deviation，σr）和廠家聲明的室內標準偏差（manufactur's claim of laboratory required standard deviation，σl）進行比較，若小于廠家提供的標準偏差，結果可以接受。若大于廠家提供的標準偏差，則進行統(tǒng)計學分析。Sr：批內不精密度；sl：室內不精密度；D：實驗天數(shù)；n：實驗次數(shù)；Sb：批間不精密度；x：總均值；σr：廠家聲明的批內標準偏差；σl：廠家聲明的室內標準偏差；CVr：廠家聲明的批內變異系數(shù)；CVl：廠家聲明的室內變異系數(shù)。1.4.2 正確度評價

參考EP15-A2[6]文件。收集乙型肝炎患者血清20份，每天分別用高敏檢測試劑和COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系統(tǒng)檢測，每天檢測5個樣本，連續(xù)測4天，由公式⑤計算偏倚標準差（standard deviation of bias，Sb），并與廠家聲明的偏倚進行比較。Sb：偏倚標準差；bi=試驗方法結果i-比較方法結果i；：平均偏倚；n：實驗次數(shù)。

1.4.3 分析測量范圍（analytical measurement range，AMR）評價

參考EP6-A[7]。將定值高濃度標準品（7.5×1010IU/mL）用HBV陰性血清作系列稀釋，稀釋后HBV DNA 濃度分別為 109、108、107、106、105、104、103、102、50、25、20、10、5、2.5 IU/mL，與陰性質控品一同重復檢測3次。采用平均斜率法進行線性評價。

1.4.4 臨床可報告范圍（clinical reportable range，CRR）評價

參考EP6-A[7]。選擇濃度在廠家說明書聲明的分析測量范圍內的高值標本5份，用陰性血清分別進行 1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640稀釋并檢測，根據(jù)預期值和實測值計算稀釋回收率，回收率在90%～110%為合格，確定最大稀釋度。將定值高濃度標準品（7.5×1010IU/mL）系列稀釋為100、50、25、20、10、5 IU/mL并進行檢測，連續(xù)檢測6天，每天檢測1次，計算重復檢測變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），得出功能靈敏度（即天間重復測量時變異系數(shù)為20%的檢測限）。結合功能靈敏度、分析測量范圍及最大稀釋度確定臨床可報告范圍。

1.4.5 最低檢測限評價

參考 EP17-A[8]。將定值高濃度標準品（7.5×1010IU/mL）用HBV陰性血清系列稀釋為100、50、25、20、10、5、2.5 IU/mL 并進行檢測，重復檢測6次，計算HBV DNA檢出率及與理論值的偏倚。

1.4.6 儀器間比對及相關性評價

參考EP9-A2[9]。選取臨床慢性乙肝患者血清樣本44份，樣本濃度盡量覆蓋試劑盒的線性檢測范圍，分別用高敏試劑和COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系統(tǒng)檢測，分析2種方法的相關性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用Microsoft Excel 2010和MedCalc等軟件進行統(tǒng)計學分析。計算計量資料的均數(shù)、方差、標準差和CV，線性范圍采用平均斜率法，2種定量檢測結果比對采用Deming回歸分析相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 精密度評價

批內精密度：高、中、低值標本的批內不精密度 sr分別為 0.069、0.085、0.059，均分別小于廠家聲明的標準差 σ（0.799、0.592、0.398）。室內精密度：高、中、低值標本的室內不精密度sl分別為0.083、0.138、0.117，均分別小于廠家聲明的標準差σ（0.799、0.592、0.398）。

2.2 正確度評價

采用高敏試劑和COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan檢測系統(tǒng)同時檢測20例患者標本，所得結果作偏倚圖（見圖1），可知2種檢測方法的結果一致，偏倚標準差（standard deviation of bias，Sb）為 0.25 lg值，小于廠家聲明的偏倚0.45 lg值。

圖1 高敏試劑和COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan檢測系統(tǒng)檢測結果的偏倚圖Figure 1 Bias diagram of the results of high sensitivity test kit and COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Detection system

2.3 分析測量范圍評價

對各梯度濃度測量結果做平均斜率法以驗證分析測量范圍。計算各組測量結果的變異系數(shù)CV，與廠家聲明的精密度（10%）比較。以預期濃度lg值為X，測量濃度均值lg值為Y，做散點圖（圖2），為直線關系，然后作直線回歸?；貧w方程為y=1.027 7x-0.082，斜率b1=1.027 7，在0.97～1.03 之間，截距b0=0.082，r2=0.999 6。該方法在實驗所涉及的濃度范圍內25～（1.0×109）IU/mL成線性。

圖2 HBV DNA定量預期值和測量均值散點圖Figure 2 HBV DNA quantitative expected value and measured mean scattered plot

2.4 臨床可報告范圍評價

2.4.1 回收率及最大稀釋度

對3個標本的原血清和各稀釋度血清進行檢測后，計算稀釋回收率：稀釋回收率=（實測值/預期值）×100%，回收率在90%～110%為合格，得出最大稀釋度為1∶80。

2.4.2 功能靈敏度

對各濃度的樣本重復檢測6次，計算CV，10 IU/mL濃度組的CV為18.10%，小于20%，符合廠家聲明的功能靈敏度（20 IU/mL）。

2.4.3 臨床可報告范圍

臨床可報告范圍上限為分析測量范圍上限乘以最大稀釋度，結合上述實驗得到的功能靈敏度10 IU/mL，高敏試劑的臨床可報告范圍為10～（8.0×1010）IU/mL。

2.5 最低檢測限評價

高敏試劑對 100、50、25、20、10、5 IU/mL 6個濃度水平樣本的檢出率均為100%，2.5 IU/mL濃度水平檢出率為66.67%，最低檢測限為5 IU/mL，符合廠家聲明的檢測下限（20 IU/mL）。

2.6 儀器間比對及相關性評價

將44份慢性乙肝患者血清樣本同時用高敏試劑和COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系統(tǒng)檢測，對測定結果做Deming回歸分析，回歸方程為y=0.987 6x+0.189 4，相關系數(shù)r=0.975 4（P＜0.05），可知高敏試劑和 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan檢測系統(tǒng)的相關性好，結果見圖3。

圖3 Deming線性回歸圖Figure 3 Deming linear regression diagram

3 討論

HBV感染的病原學診斷方法目前主要有免疫學方法檢測HBV的血清學標志物和分子生物學方法檢測HBV核酸[10-11]。免疫學方法檢測病毒抗原或抗體僅提供HBV感染的間接證據(jù)，其出現(xiàn)晚于HBV DNA的出現(xiàn)，且在病毒感染的窗口期不能檢測到抗體，這在很大程度上限制了免疫學方法的應用[12]。采用分子生物學方法檢測HBV DNA，可為早期診斷HBV感染、判斷病毒復制程度、進行HBV基因分型及耐藥性檢測等提供更多的信息[13-16]。熒光定量PCR法定量檢測HBV DNA，能準確地反映HBV DNA的復制水平，在治療監(jiān)測、判斷治療終點等中有重要的應用價值[17-18]。最新國際和國內的乙型肝炎防治指南推薦使用高敏檢測方法檢測HBV DNA，以幫助判斷治療終點。如亞太肝病研究學會建議，對于應用核苷酸類藥物治療的HBeAg陽性者，當HBeAg發(fā)生血清學轉換，且HBV DNA至少12個月低于檢測水平（10～15 IU/mL）時，可考慮停藥[4-5]。我國藥物監(jiān)督管理局在2013年《乙型肝炎病毒DNA定量檢測試劑注冊申報資料技術指導原則》中將HBV DNA的最低檢測限定為不大于30 IU/mL[19]。高敏HBV DNA定量檢測在臨床中的作用越來越重要，未來將逐步取代傳統(tǒng)低敏試劑檢測[20]。

區(qū)別于傳統(tǒng)的手工提取核酸方法，Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)可自動進行核酸提取、擴增前PCR反應體系構建等全過程，所需的人工操作僅為樣本與試劑的準備和擺放。Pre-NAT系統(tǒng)分為4大模塊，包括樣本加載、試劑分裝、核酸提取和PCR體系構建等模塊。其采用獨家專利的聚乙烯醇磁珠，在低鹽環(huán)境下展現(xiàn)出對DNA的獨特吸附能力，對蛋白的結合非常弱，并且轉移磁珠的方法減少了液體或氣溶膠暴露而產(chǎn)生的污染，保證了核酸提取的得率、純度、安全性和穩(wěn)定性。另外，Pre-NAT系統(tǒng)還具有樣本通量大（96），滿通量處理時間較短（140 min）、樣本用量少和紫外燈防污染等特點，能夠很好地提高實驗效率和質量，節(jié)約勞動力，減少手工操作帶來的污染和誤差。

本研究主要參考CLSI的EP6-A、EP9-A2、EP15-A2和EP17-A等文件[6-9]，對基于Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)的HBV DNA高敏定量檢測試劑盒進行性能驗證。本研究得到的數(shù)據(jù)顯示：高、中、低值標本的批內不精密度sr和室內不精密度sl均分別小于廠家聲明的標準差σ，表明精密度通過驗證，可以在臨床應用。實驗室對正確度的評價過程實際上就是偏倚計算的過程，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)計算得出的偏倚小于廠家聲明的偏倚，表明該實驗方法得到的偏倚滿足要求，正確度通過驗證。本研究采用平均斜率法回歸分析進行分析測量范圍（AMR）的評價，根據(jù)統(tǒng)計結果得知預期值與測量值之間相關性較好，且在25～1.0×109IU/mL內成線性，與廠家聲明的線性范圍20～（1.0×109）IU/mL相較，AMR下限不符合廠家聲明，考慮可能是由高值標準品稀釋到相應低濃度水平引起的誤差，需要后續(xù)補充試驗進一步驗證。高敏試劑盒檢測低限為25 IU/mL，與羅氏COBAS系統(tǒng)檢測靈敏度（20 IU/mL）幾乎相當，比目前國內常用HBV定量試劑盒更靈敏，達到2013年國家食品藥品監(jiān)督管理總局技術評審中心提出的HBV DNA最低檢測限應小于30 IU/mL的要求[19]。本研究主要設計了兩方面實驗以驗證Pre-NAT系統(tǒng)的臨床可報告范圍（CRR），包括最大稀釋度的確定和功能靈敏度的驗證。最大稀釋度的確定主要通過計算回收率，依據(jù)結果可知1∶160稀釋度組的回收率已超過合格范圍，因此選擇1∶80作為最大稀釋度，其乘以AMR上限即為CRR上限。因此本實驗得到的功能靈敏度為10 IU/mL，低于廠家聲明的功能靈敏度20 IU/mL。由最低檢測限實驗結果可見，5 IU/mL濃度水平及以上的檢出率均為100%，符合廠家聲明的檢測下限（20 IU/mL）。方法學比對中選擇COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48病毒載量系統(tǒng)作為比較方法，選用Deming線性回歸分析法，使用統(tǒng)計軟件得出回歸方程為y=0.987 6x+0.189 4，r=0.975 4，（P＜0.05），可知兩者相關性較好，說明2種方法的結果具有可比性。另外，本研究未涉及Pre-NAT系統(tǒng)及該試劑盒抗干擾能力的評價，期待后續(xù)實驗補充完善。

綜上所述，對基于Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)的HBV DNA高敏定量檢測試劑盒的精密度、正確度、分析測量范圍、臨床可報告范圍、最低檢測限及方法學比對等性能進行驗證，均表現(xiàn)良好，與廠家聲明基本一致，達到了應用于臨床的要求，也為分子生物學檢驗實現(xiàn)自動化作出了貢獻。