李飛 李麗娟 梁德志 王鳳平 張拔山

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是臨床最常見的機(jī)會(huì)致病菌之一，在非發(fā)酵革蘭陰性菌中其分離量占第一位（45.4%）[1]。曾經(jīng)認(rèn)為亞胺培南是用于治療銅綠假單胞菌感染最有效的臨床藥物，隨著抗生素選擇壓力增加，銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥情況日趨嚴(yán)重，常呈多重耐藥，給臨床抗感染治療帶來了新的挑戰(zhàn)，使得臨床抗感染治療的難度大大增加[2-5]。耐亞胺培南銅綠假單胞菌（imipenem resistancePseudomonas aeruginosa，IMPRPAE）的耐藥機(jī)制國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類耐藥機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：碳青霉烯酶的產(chǎn)生、AmpC酶、ESBLs、外膜孔蛋白缺失和外排泵超表達(dá)等。本研究選取2016年1月至2017年12月東莞地區(qū)2家醫(yī)院臨床送檢標(biāo)本110株IMPRPAE，從MBLs基因檢測(cè)，oprD基因檢測(cè)以及oprDmRNA表達(dá)水平檢測(cè)三方面著手，分析其耐藥特征以及耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

選取2016年1月至2017年12月東莞市人民醫(yī)院及東莞市東華醫(yī)院臨床送檢標(biāo)本分離的110株耐亞胺培南銅綠假單胞菌，送檢標(biāo)本類型包括痰液、尿液、血液、分泌物等。所有標(biāo)本保存于脫脂牛奶，-70℃保存。同一患者分離得到的菌株不重復(fù)計(jì)入。實(shí)驗(yàn)時(shí)把菌株從脫脂牛奶復(fù)蘇到血平板，再從血平板中挑取純菌株的單個(gè)菌落備用。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器設(shè)備與試劑

VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)購自法國(guó)生物梅里埃公司；bioMérieux DENSIMAT比濁儀購自法國(guó)生物梅里埃公司；CHEF-DRIII電泳儀購自美國(guó)生物伯樂公司。RNA提取試劑盒購自LIFE公司；BestarTMqPCR RT Kit試劑盒購自上海星漢生物科技公司；細(xì)菌鑒定卡（GN）以及藥敏卡（AST-GN10）購自廣州市番禺華鑫科技有限公司；40U SpeI購自大連生物工程公司，DNA提取試劑購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2.2 藥敏方法

所有菌株均以VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀鑒定到種。根據(jù)2016年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）規(guī)定的常規(guī)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[6]，選擇AST-GN10藥敏卡上的氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、復(fù)方新諾明16種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。使用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，K-B法）進(jìn)行美羅培南藥敏試驗(yàn)。其中美羅培南的判斷折點(diǎn)主要依據(jù)CLSI判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：抑菌圈直徑≥19 mm為敏感，抑菌圈直徑＝16～18 mm為中介，抑菌圈直徑≤15 mm為耐藥。

1.2.3 脈沖凝膠電泳（plused field gel electrophoresis，PFGE）

挑取單菌落接種營(yíng)養(yǎng)平板，37度孵育過夜。用bioMérieux DENSIMAT比濁儀調(diào)整細(xì)菌懸液濃度，使?jié)岫葹?.8～4.2。加入1%Seakem Gold膠，混勻制備膠塊。使用含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液（cell lysis buffer，CLB）消化2 h。純水清洗膠塊2次；TE（10 mmol/L Tris：1 mmol/L EDTA，pH 值 8.0）清洗膠塊4次。使用40 U SpeI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，在37℃孵育4 h。在CHEF-DRIII電泳儀中進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳。電泳參數(shù)為 5 s～15 s，9 h；15 s～50 s，9 h。電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色。在讀膠儀中成像，并轉(zhuǎn)換成TIFF圖像格式保存。PFGE圖像錄入BioNumerics軟件包進(jìn)行處理，識(shí)別圖像條帶，經(jīng)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。分子量標(biāo)準(zhǔn)用沙門菌H9812經(jīng)過XbaI酶切后的片段。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

MBLs基因以及oprD基因應(yīng)用Oligo 7軟件（Molecular Biology Insights，Inc.Co，美國(guó)）設(shè)計(jì)引物，委托上海賽默飛世爾科技公司合成，相關(guān)基因的引物序列見表1，引物設(shè)計(jì)參考國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]。PCR擴(kuò)增體系為：2.5 μL 10×Taq Buffer（20 mM Mg2+），0.5 μL dNTPs（2.5 mmol/L），上下游引物各 1 μL（10 μmol/L），DMSO 2.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL（1.5 U/μL），DNA模板50～100 ng，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。MBLs的熱循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min后，30個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，52℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，最后 72℃延伸5 min后擴(kuò)增完畢。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，以100 bp DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)確定位點(diǎn)分子質(zhì)量，空白水為陰性對(duì)照，出現(xiàn)與目的產(chǎn)物分子相當(dāng)?shù)臈l帶為陽性。oprD的熱循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性10 min，30個(gè)循環(huán)：95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸 10 min后擴(kuò)增完畢。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以100 bp DNA Marker為標(biāo)準(zhǔn)確定位點(diǎn)分子質(zhì)量，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853作為陽性對(duì)照。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used for gene amplification

1.2.5 Sanger測(cè)序基因測(cè)序和分析

純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物送上海Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。oprD測(cè)序產(chǎn)物分別在假單胞菌基因組網(wǎng)站（www.pseudomonas.com）和 NCBI網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析獲得的序列，分析其突變情況。MBLs測(cè)序產(chǎn)物與NCBI網(wǎng)站（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi））比對(duì)分析獲得序列。

1.2.6 熒光定量PCR（real time quantitative-PCR，qRT-PCR）檢測(cè)oprD因mRNA的表達(dá)

按照RNA提取試劑盒說明書提取PA的總RNA。RNA定量后，取等量RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用BestarTMqPCR RT Kit試劑盒進(jìn)行目的基因oprD基因mRNA的檢測(cè)，管家基因rpsL作為內(nèi)參。oprD基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量通過與標(biāo)準(zhǔn)PAO1菌株做比較。oprD基因mRNA表達(dá)量減少與標(biāo)準(zhǔn)PAO1菌株相關(guān)，即標(biāo)準(zhǔn)PAO1菌株oprD基因mRNA表達(dá)量被賦值為1.0，若其他菌株oprD基因轉(zhuǎn)錄水平小于其70%時(shí)，被認(rèn)為其表達(dá)量減少[11]。并且選取10株亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌均同時(shí)檢測(cè)其oprD基因mRNA表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR引物的核苷酸序列見表2。

表2 PCR引物序列Table 2 Primers used for gene amplification

2 結(jié)果

2.1 IMPRPAE耐藥特點(diǎn)

IMPRPAE對(duì)阿米卡星的耐藥率為10.00%，對(duì)妥布霉素、慶大霉素、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率在17.27%～21.82%，對(duì)頭孢他啶、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率26.36%～31.82%，對(duì)其余β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素、磺胺類抗菌藥物耐藥嚴(yán)重，結(jié)果見表3。

2.2 IMPRPAE的流行病學(xué)分析（PFGE）

本研究調(diào)查了110株P(guān)A，所有分離菌株對(duì)亞胺培南耐藥。而對(duì)美羅培南敏感或中介的菌株共32株（29.09%），其中敏感株14個(gè)，中介株18個(gè)，判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）規(guī)范化操作。

110株P(guān)A PFGE聚類圖見圖1。110株菌分為84個(gè)不同的帶型，其中70個(gè)帶型只包含1株菌，即有70株菌具有獨(dú)特的PFGE帶型?？偟膩碚f，PFGE顯示其具有高度克隆多樣性（如圖1），盡管有一個(gè)包含菌株最多的帶型包含5株。

2.3 PCR法分析MBL基因和oprD基因以及其測(cè)序結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)110株IMPRPAE中產(chǎn)MBLs陽性菌株共有18株，陽性菌株進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果直接在GenBank中進(jìn)行序列對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)有9株檢出是IMP-25，8株檢出是VIM-2，4株檢出是SIM-2，有3株同時(shí)檢出即有VIM-2又有SIM-2。分別與IMP-25GenBank注冊(cè)號(hào)EU352796，VIM-2GenBank注冊(cè)號(hào)AF191564以及SIM-2GenBank注冊(cè)號(hào)KT013203相同。

表3 IMPRPAE對(duì)常用抗菌藥物的藥敏率（%）（n=110）Table 3 Sensitivity of imipenem-resistant pseudomonas aeruginosa to frequently-used antimicrobial drugs（%）（n=110）

110株P(guān)A菌中107株oprD基因擴(kuò)增陽性，3株陰性，缺失率為2.73%。陽性菌株基因測(cè)序表明其中7株無中斷突變，84株伴有移碼突變，16株伴有一個(gè)堿基單點(diǎn)突變而致終止密碼子提前出現(xiàn)（表4）。移碼移位所致突變其中共有8株伴有IS序列插入，主要發(fā)現(xiàn)了ISPpu29、ISPpu21、IS1394以及ISPst2 4種插入序列類型。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)oprD基因mRNA的表達(dá)結(jié)果

檢測(cè) 7株（編號(hào)為：5，11，18，23，43，81和107）無中斷突變株其oprD的mRNA表達(dá)水平。與PAO1相比，所有菌株oprD表達(dá)量降低（從0.06到0.65）（表5）。對(duì)10株亞胺培南敏感的PA其oprD的表達(dá)也進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沒有任何一個(gè)菌株其oprD表達(dá)量降低，其范圍從1.23到12.94。

圖1 110株P(guān)A PFGE聚類圖Figure 1 Dendrogram based on PFGE profiles of imipenemresistant PA isolates

表4 IMPRPAE oprD基因突變類型Table 4 The types of oprD gene mutation in IMPRPAE

3 討論

目前，臨床已廣泛使用亞胺培南用于治療感染銅綠假單胞菌，使得越來越多的耐亞胺培南銅綠假單胞菌產(chǎn)生了耐藥性[12]。2015年一項(xiàng)薈萃分析研究顯示[13]，銅綠假單胞菌碳青霉烯耐藥率在8.7%至50.4%之間。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)告2016年銅綠假單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥性仍處于較高水平[4]。本組研究發(fā)現(xiàn)110株耐亞胺培南銅綠假單胞菌除對(duì)阿米卡星敏感率較高達(dá)87.27%，而對(duì)其他藥物耐藥率都很高，甚至有7種藥物耐藥率在90%以上，由此可知銅綠假單胞菌的耐藥情況已十分嚴(yán)峻，對(duì)于在臨床診療過程中應(yīng)重視和加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)，并合理地應(yīng)用和優(yōu)先選用低耐藥可能性的抗菌藥物，減少耐藥菌株在院內(nèi)的擴(kuò)散。

表5 無中斷突變株其oprD基因的mRNA表達(dá)水平Table 5 The mRNA expression of the oprD gene without disrupted mutation

銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，其中最主要的耐藥機(jī)制包括以下幾個(gè)方面：①產(chǎn)碳青霉烯酶：銅綠假單胞菌中常見的碳青霉烯酶為金屬β-內(nèi)酰胺酶。目前發(fā)現(xiàn)的獲得性金屬β-內(nèi)酰胺酶包括：IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM9種，其中以IMP和VIM常見[14-15]。本研究110株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)18株（16.36%）耐藥菌株攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶，主要包括IMP-25，VIM-2，SIM-2，這也說明了金屬β-內(nèi)酰胺酶在銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)金屬β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)陽性率均低于20%[17-18]。而方小龍等研究發(fā)現(xiàn)2013年至2015年深圳地區(qū)金屬β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)陽性率32.8%結(jié)果較不一致[15]。本組研究發(fā)現(xiàn)金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的存在以及產(chǎn)生金屬酶是本地區(qū)銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的機(jī)制之一，可能還存在其他主要耐藥機(jī)制。②外排泵高表達(dá)：銅綠假單胞菌染色體上存在多種外排泵基因，外排泵可將多種有毒物質(zhì)、藥物等排出細(xì)菌體內(nèi)；正常情況下外排泵表達(dá)較低，對(duì)碳青霉烯耐藥性無影響，但外排泵高表達(dá)時(shí)，可引起對(duì)亞胺培南及美羅培南的外排增加，從而增加其耐藥性[2]。③外膜通透性降低：銅綠假單胞菌外膜通透性低，碳青霉烯無法直接通過其外膜，需借助外膜上的孔道蛋白o(hù)prD進(jìn)入細(xì)菌發(fā)揮作用，因此外膜蛋白o(hù)prD缺失或表達(dá)降低都會(huì)導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯的耐藥性增加[18-19]。本研究110株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)oprD缺失的有3株（2.73%），與這與顏英俊等[20]報(bào)道結(jié)果一致。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道oprD缺失是PAE對(duì)IMP耐藥的主要機(jī)制，例如閆玉蘭等人[6]發(fā)現(xiàn)oprD缺失率高達(dá)86.8%。而也有相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)oprD缺失率較低，例如廣東中山地區(qū)王娟等人[21]發(fā)現(xiàn)oprD缺失率為16.3%，哈爾濱地區(qū)多麗波等人[22]發(fā)現(xiàn)oprD缺失率為26.19%，北京地區(qū)楊春等人[23]發(fā)現(xiàn)oprD缺失率為56.1%，這說明菌株耐藥具有地域性。不同地域耐藥菌株oprD缺失率不一樣，本研究oprD缺失率為2.73%，與廣東中山地區(qū)[21]oprD缺失率低較一致。oprD缺失率低不排除因oprD基因突變或基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致PA對(duì)IMP耐藥，于是我們進(jìn)一步對(duì)107株陽性菌株進(jìn)行了oprD基因測(cè)序檢測(cè)和mRNA表達(dá)量檢測(cè)。而國(guó)內(nèi)其他大部分研究者[21-23]僅檢測(cè)了oprD基因，并未對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，無法判斷oprD突變情況，本研究進(jìn)一步完善了此部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。本組結(jié)果提示其中有100株（90.91%）發(fā)生了有意突變，對(duì)7株（6.36%）無中斷突變株進(jìn)行mRNA表達(dá)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其mRNA表達(dá)量均減少，與國(guó)內(nèi)顏英俊[21]報(bào)道結(jié)果一致，同時(shí)本研究組在國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌外膜蛋白o(hù)prD基因中插入IS序列，包括IS1394、ISPpu29以及ISPst2。本研究進(jìn)一步證實(shí)oprD缺失，發(fā)生廣泛有意突變以及mRNA表達(dá)減少是導(dǎo)致導(dǎo)致本組PA對(duì)IMP耐藥的主要機(jī)制。

綜上所述，IMPRPAE對(duì)常用抗菌藥物耐藥情況非常嚴(yán)峻，PA對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)酶、膜孔蛋白o(hù)prD基因缺失以及外排泵出機(jī)制三者有著密不可分的關(guān)聯(lián)，即可單獨(dú)存在，又可同時(shí)存在。臨床上應(yīng)該重視和加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)，合理地應(yīng)用低耐藥的抗菌藥物，在一定程度上控制和避免耐亞胺培南銅綠假單胞菌的大量出現(xiàn)和流行爆發(fā)。