張國棟 宋剛 李明輝

肺結(jié)核是一種因結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的肺部傳染病，患者的主要癥狀表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、咯血及乏力等癥狀，對患者的生命安全造成嚴(yán)重危害[1]。肺結(jié)核的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，與患者的基因、病菌的毒性及生活環(huán)境等多種因素密切相關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1及巨噬細(xì)胞移動抑制因子等重要免疫蛋白的基因多態(tài)性異常與結(jié)核分枝桿菌的易感性明顯相關(guān)，這表明宿主的遺傳因素對肺結(jié)核的發(fā)展有重要影響[3]。ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1（Arf-GAP with SH3 domain ANK repeat and PH domain-containing protein，ASAP1）是一類分子量為 20～40 kD的單體GTP結(jié)合蛋白，與GTP酶激活蛋白結(jié)合后發(fā)揮GTP酶活性，可增強巨噬細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白應(yīng)激纖維的功能，從而有利于細(xì)胞提升細(xì)胞運動能力[4]。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 M3（glutathione S-transferase M3，GSTM3）是一種含225個氨基酸的蛋白，具有催化谷胱甘肽等抗氧化因子與超氧化物反應(yīng)的功能，從而可減輕細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)ASAP1及GSTM3基因多態(tài)性可對人體的免疫功能產(chǎn)生影響，從而降低機(jī)體對病菌的免疫能力[6]。本研究對肺結(jié)核患者中ASAP1基因及GSTM3基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，分析ASAP1基因及GSTM3基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感的相關(guān)性，為肺結(jié)核的高危人群篩選及臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇自2017年2月至2018年4月在重慶市長壽區(qū)公共衛(wèi)生服務(wù)中心接受治療的196例肺結(jié)核患者為病例組，其中男性109例，女性87例，年齡24～63歲，平均年齡（32.58±2.96）歲。選擇在重慶市長春區(qū)公共衛(wèi)生服務(wù)中心體檢正常的160例健康人為對照組，其中男性84例，女性76例，年齡21～58歲，平均年齡（34.65±3.27）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均為漢族并無遺傳??；②患者均經(jīng)影像學(xué)檢查、痰結(jié)核菌涂片等方法確診為肺結(jié)核病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者的基本臨床資料缺失；②患者伴發(fā)腫瘤、高血壓及重要器官衰竭；③伴發(fā)哮喘、氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病。所有研究對象均知情同意，且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

基因組DNA提取試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；PCR試劑盒購自金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 基因多態(tài)性檢測

采集受試者外周血5 mL，EDTA-Na2抗凝，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，基因組DNA經(jīng)Nanodrop分光光度計檢測合格后，置于4℃冰箱保存。采用限制性片段長度多態(tài)性方法（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）分析基因型多態(tài)性，按照Prime 6.0軟件設(shè)計引物，ASAP1基因T2475G位點：上游引物5′-CTGACGTCCATCCATCACTC-3′，下游引物 5′-CTGACGTCAGTCACTCATGCAC-3′。GSTM3基因A3207C位點：上游引物5′-GTCATCATCATCATCCATGCATC-3′，下游引物 5′-CTGGACTGCATCTGCATC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃25 s，反應(yīng)32個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后72℃5 min。然后采用Kas I限制性內(nèi)切酶處理ASAP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物，采用BsP63I限制性內(nèi)切酶處理GSTM3基因擴(kuò)增產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，分析酶切產(chǎn)物的條帶數(shù)目判斷基因型，同時將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技有限公司測序驗證。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗；計數(shù)數(shù)據(jù)以率表示，采用χ2檢驗。肺結(jié)核易感性危險因素采用多因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組及病例組的一般資料

2組的年齡、性別、體重、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、飲酒史及吸煙史差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。病例組的總膽紅素為（1.36±0.24）mg/dL，C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）為（7.84±1.34）mg/L，白細(xì)胞數(shù)為（9.26±1.38）×109/L，均明顯高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 2組一般資料對比Table 1 Comparison of the 2 groups of general data

2.2 ASAP1基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的分析

病例組ASAP1基因T2475G位點基因型TT、GT及GG分別為59例、32例及105例，與對照組基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。病例組T2475G位點G等位基因比例為68.6%，顯著高于對照（P＜0.05），見表2。

2.3 GSTM3基因A3207C位點多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的分析

病例組GSTM3基因A3207C位點多態(tài)性位點基因型AA、AC及CC分別為46例、67例及83例，與對照組基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。病例組C等位基因比例為59.4%，顯著高于對照組（P＜0.05），見表3。

2.4 肺結(jié)核易感性的危險因素分析

以肺結(jié)核感染為因變量，將本研究受試者的年齡、性別、體重、BMI、飲酒史、吸煙史、總膽紅素、CRP、白細(xì)胞數(shù)值進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)T2435G及A3207C位點多態(tài)性是肺結(jié)核感染的危險因素（P＜0.05），見表4。

表2 ASAP1多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性[n（%）]Table 2 Association between ASAP1 polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis[n（%）]

3 討論

人體對結(jié)核分枝桿菌免疫機(jī)制較為復(fù)雜，巨噬細(xì)胞可吞噬侵入的致病菌，并將免疫信號傳遞至T淋巴細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞，進(jìn)一步增強人體對結(jié)核分枝桿菌的免疫能力[7]。有流行病學(xué)研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的感染者中約有10%的感染者可轉(zhuǎn)化為活動性肺結(jié)核，并且不同族群及人種的肺結(jié)核發(fā)病率有一定的差異，這表明宿主的基因遺傳特征與肺結(jié)核的易感染性有密切關(guān)系[8-9]。麥志丹等[10]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α-308基因多態(tài)性多態(tài)性與肺結(jié)核的易感性密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)75.3%的肺結(jié)核患者ATG4A及ATG16L1基因多態(tài)性與健康者有顯著差異[11]。這表明某些基因的多態(tài)性可能會對肺結(jié)核的易感性產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)ASAP1及GSTM3基因多態(tài)性可能對免疫細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，從而降低機(jī)體對外界病菌的抵抗力[12]。因此，研究ASAP1及GSTM3基因與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性有助于結(jié)核病的預(yù)防及治療。

表3 GSTM3多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性Table 3 Association between GSTM3 polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis

表4 肺結(jié)核易感性的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multiple factor Logistic regression analysis of susceptibility of pulmonary tuberculosis

ASAP1蛋白主要位于細(xì)胞的高爾基體上，參與細(xì)胞囊泡物質(zhì)運輸，且是構(gòu)成細(xì)胞偽足、黏著斑的重要組成分子，可增強某些細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）的黏附及運動功能[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)ASAP1基因轉(zhuǎn)錄或翻譯發(fā)生障礙后，可導(dǎo)致細(xì)胞的偽足運動功能下降[14]。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌分泌的某些有毒物質(zhì)可能干擾巨噬細(xì)胞ASAP1基因的表達(dá)，進(jìn)一步削弱巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的免疫功能[15]。本研究發(fā)現(xiàn)病例組ASAP1基因T2475G位點基因型TT的比例明顯高于GT及GG型的比例，提示ASAP1基因T2475G位點與肺結(jié)核易感性相關(guān)。有研究通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)巨噬細(xì)胞中ASAP1基因表達(dá)水平后，巨噬細(xì)胞識別、捕獲結(jié)核分枝桿菌的能力明顯下降，并干擾巨噬細(xì)胞向其它免疫細(xì)胞傳遞免疫信號[16]。Faghfoori等[17]研究發(fā)現(xiàn)ASAP1基因的多態(tài)性可影響肺結(jié)核患者的免疫功能，從而提高了結(jié)核桿菌對機(jī)體的侵染力。這表明ASAP1基因的多態(tài)性促使ASAP1蛋白活性降低或表達(dá)水平降低，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的識別及運動功能障礙，可能是導(dǎo)致肺結(jié)核易感性上升的誘因。GSTM3可以催化谷胱甘肽與細(xì)胞內(nèi)的氧自由基等活性氧反應(yīng)，因而可抑制活性氧對巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的攻擊，提高機(jī)體的免疫功能。有研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血漿中的GSTM3蛋白水平顯著低于正常人，提示GSTM3與肺結(jié)核的發(fā)生密切相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)病例組GSTM3基因A3207C位點基因型CC比例明顯高于AA及AC型的比例，提示GSTM3基因多態(tài)性對肺結(jié)核的發(fā)生產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者GSTM3基因的A3207C位點為CC型的比例為51.4%，與肺結(jié)核易感性明顯相關(guān)[18]，與本研究一致。這可能是由于GSTM3基因A3207C位點CC基因型促使GSTM3蛋白結(jié)構(gòu)異?；蜣D(zhuǎn)錄水平下降，導(dǎo)致免疫細(xì)胞受到氧自由基或過氧化物攻擊，從而降低患者的免疫系統(tǒng)功能。有研究通過TaqMan基因技術(shù)分析肺結(jié)核患者體內(nèi)GSTM3基因中A3207G和C1305G位點多態(tài)性特征，發(fā)現(xiàn)這2個位點的基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性無顯著相關(guān)性[19]。這表明GSTM3基因SNP位點多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系較為復(fù)雜，GSTM3基因中的多個SNP多態(tài)位點可能產(chǎn)生交互作用，進(jìn)而對GSTM3基因的表達(dá)產(chǎn)生不同的影響。多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)T2475G位點及A3207C位點的多態(tài)性是肺結(jié)核發(fā)生的危險因素。ASAP1基因及GSTM3基因多態(tài)性作為宿主的遺傳特征，并不受外界干擾因素的影響，檢測ASAP1基因及GSTM3基因多態(tài)性對篩查肺結(jié)核易感性人群有較高臨床價值。

綜上所述，ASAP1基因及GSTM3基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性密切相關(guān)，通過檢測ASAP1基因及GSTM3基因多態(tài)性可評估受試者肺結(jié)核易感性。但由于影響肺結(jié)核的發(fā)病的基因較多，需進(jìn)一步檢測其它可能的易感基因進(jìn)行綜合分析，以期提高對肺結(jié)核的防治水平。