梁爽 王偉偉 孫力 鄒廣慧 董志武★

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是臨床上常見(jiàn)的代謝性疾病，其中Ⅱ型糖尿?。╰ype 2 diabetes Mellitus，T2DM）約占 DM 的 90%[1]。而 T2DM 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳與環(huán)境在T2DM過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[2]。近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)研究已成為研究糖尿病發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)指在不影響DNA序列的情況下基因修飾的改變，主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)修飾、基因組印記等[3]，其中最常見(jiàn)的表觀遺傳修飾方式為DNA甲基化。DNA甲基化在胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸（cytosinephosphate-guanine，CpG）豐富的序列，也稱(chēng)為“CpG島”，位于已知基因的啟動(dòng)子區(qū)域，其作用主要是導(dǎo)致基因表達(dá)的沉默[4]。

PPARGC1蛋白家族有3個(gè)成員：α，β和α相關(guān)協(xié)同激活因子，主要在富含線(xiàn)粒體的組織中表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)糖類(lèi)與脂類(lèi)代謝、脂肪酸β氧化、脂肪細(xì)胞分化等多種代謝過(guò)程[5]。有研究發(fā)現(xiàn)在多種糖尿病研究模型及人種中PPARGC1的異常表達(dá)，并參與了線(xiàn)粒體的生物形成和脂肪酸的β氧化等過(guò)程，是線(xiàn)粒體基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子[6]。另外研究顯示PPARGC1參與T2DM的發(fā)病機(jī)制可能與患者胰腺PPARGC1啟動(dòng)子DNA甲基化水平升高，PPARGC1基因mRNA表達(dá)減少，從而引起胰島素分泌減少相關(guān)[7]。因此，PPARGC1基因是研究T2DM發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵候選基因。

本研究旨在探討T2DM的危險(xiǎn)因素及PPARGC1啟動(dòng)子甲基化與T2DM發(fā)病的相關(guān)性，嘗試從表觀遺傳學(xué)解釋T2DM的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取于2015年1月至2017年12月在上海市第六人民醫(yī)院金山分院體檢或住院期間診斷為T(mén)2DM的患者57例，將其歸為糖尿病組；其中男22例，女35例，年齡 51～66歲，平均（59.00±3.01）歲；選取同期體檢健康志愿者152例，確定為對(duì)照組；其中男 47例，女 105例，年齡 47～58歲，平均（51.00±3.23）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往明確診斷有除糖尿病以外的其他代謝性疾病，心腦血管疾病或腫瘤等疾病者以及妊娠期、哺乳期者。兩組患者性別、年齡等一般資料上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究由我院倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫研批第（201401）]，所有受試者均知情同意且簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理

將體檢當(dāng)日或入院次日清晨空腹采集靜脈血3 mL置于促凝劑分離膠管中，1 500 rpm離心10 min，檢測(cè)血清中空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和脂蛋白a（lipoprotein a，LPPA）的水平，另采集靜脈血2 mL置于EDTA·K3抗凝管，采用美國(guó)Qiagen公司的全血基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行全血基因組DNA提取。

1.2.2 重亞硫酸鹽直接測(cè)序

從糖尿病組和對(duì)照組中各隨機(jī)選取26名研究對(duì)象進(jìn)行基因組DNA提取，取1 μg提取的DNA樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。以修飾后的DNA為模板，用Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶擴(kuò)增PPARGC-1α基因啟動(dòng)子基因片段。通過(guò)Snapgene軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游引物5′-CCGTGGGATTCCGTCAATCCCTCC-3′，下游引物 5′-CTCTTTTACAGAGTATTTTTACGTAGTAC-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀記錄分析。將PCR純化產(chǎn)物連接到pUC18-T載體上，待連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后進(jìn)行藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選，篩選完利用M13+/-引物測(cè)序（ABI 3730XL測(cè)序儀，美國(guó)）。檢測(cè)啟動(dòng)子基因片段中7個(gè)CpG位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在基因序列中的位置為 28，53，86，217，252，348，354。

1.2.3 各生化指標(biāo)的檢測(cè)

所有研究對(duì)象于清晨空腹采集靜脈血，離心分離血清。采用西門(mén)子全自動(dòng)生化分析儀ADVIA2400（西門(mén)子公司，美國(guó)）及其配套相關(guān)試劑檢測(cè)FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C和LPPA水平。所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 信息調(diào)查

參考以往研究，以調(diào)查問(wèn)卷方式收集并確認(rèn)患者資料。問(wèn)卷項(xiàng)目包括個(gè)人一般情況及個(gè)人健康情況，如高血壓、冠心病、腦血管疾病，是否有家族遺傳病史等一般資料，T2DM診斷參考臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Epidata3.1建立數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)實(shí)行雙錄入法。應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Komogorov-Smirnov（K-S）正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)進(jìn)行處理，并分別采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。分類(lèi)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。Logistic回歸方法分析糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)因素，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病組與對(duì)照組單因素統(tǒng)計(jì)分析

K-S正態(tài)分析研究2組對(duì)象的臨床特征，身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、腰圍、收縮壓、TC、HDL和LDL符合正態(tài)分布；而年齡、身高、體重、舒張壓、FPG，TG和LPPA不符合正態(tài)分布。分別采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病組病人的BMI（t=2.968，P＜0.05）、腰圍（t=4.858，P＜0.05）和體重（Z=2.858，P＜0.05）均明顯增高，且其平均年齡（Z=3.924，P＜0.05）均大于正常對(duì)照（表1）；對(duì)2組樣本計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2分析，結(jié)果顯示2組間糖尿病家族史差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.711，P＜0.05），其他指標(biāo)均顯示P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 糖尿病風(fēng)險(xiǎn)多因素回歸分析

綜合單因素統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，將單因素分析結(jié)果P＜0.05的變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。以是否患糖尿病為因變量（0=否，1=是），以糖尿病家族史（X1）、年齡（X2）、腰圍（X3）、體重（X4）及BMI（X5）作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析。根據(jù)變量賦值方式的約定，入選因素的參數(shù)估計(jì)值為正，則該因素的量化值越大，越促進(jìn)糖尿病的發(fā)生；否則即為保護(hù)因素。同時(shí)，其對(duì)糖尿病患病的影響大小可由標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)估計(jì)值的大小來(lái)反映。由表2可知，糖尿病家族史、年齡、腰圍均為導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的不利因素，其OR值均＞1，糖尿病家族史OR值較大，意義更大。

表1 糖尿病組和對(duì)照組各個(gè)指標(biāo)的比較Table 1 The comparison of each index between the type 2 diabetes mellitus group and the control group

表2 糖尿病發(fā)生影響因素的Logistic回歸Table 2 The result of Logistic regression analysis of risk factors for type 2 diabetes mellitus

2.3 PPARGC1基因啟動(dòng)子甲基化與糖尿病關(guān)系回歸分析

以是否患糖尿病作為因變量（0=否，1=是），以年齡（X1）、身高（X2）、是否 久坐（X3）、PPARGC-1α甲基化（X4）及最近測(cè)量血糖和血脂時(shí)間（X5）作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示甲基化水平與糖尿病患病呈低度正相關(guān)（表3）。

表3 糖尿病發(fā)生影響因素的Logistic回歸Table 3 The result of Logistic regression analysis of risk factors for type 2 diabetes mellitus

3 討論

T2DM患病率隨著人口老齡化和人們生活方式的轉(zhuǎn)變呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，目前全球糖尿病患者約4.15億并預(yù)計(jì)在2040年達(dá)到6.42億[9]。近年來(lái)的研究調(diào)查結(jié)果顯示，T2DM與遺傳和環(huán)境因素關(guān)系密切[2]，這兩者通過(guò)表觀遺傳修飾的改變，特別是DNA甲基化，在連接遺傳和環(huán)境因素的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致T2DM的發(fā)生發(fā)展[10]。有研究發(fā)現(xiàn)PPARGC1基因編碼區(qū)突變與T2DM及相關(guān)代謝表型相關(guān)，其啟動(dòng)子變異也可能影響了PPARGC1的轉(zhuǎn)錄水平，從而參與T2DM疾病的發(fā)生[11]。

DNA甲基化水平受到環(huán)境、疾病、年齡和性別等因素的影響。已有研究證實(shí)，飲食、年齡及性別等環(huán)境因素與DNA甲基化修飾顯著相關(guān)[12]。本研究通過(guò)對(duì)糖尿病組與對(duì)照組樣本臨床特征分析發(fā)現(xiàn)，2 組樣本中，患者的 BMI（t=2.968，P＜0.05）、腰圍（t=4.858，P＜0.05）和體重（Z=2.858，P＜0.05）、年齡（Z=3.924，P＜0.05）、糖尿病家族史（χ2=7.711，P＜0.05）為糖尿病患病危險(xiǎn)因素；與前期研究結(jié)果相符[13]。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果糖尿病家族史（OR=4.676；95%CI：1.788～12.230；P＜0.05）、年齡（OR=1.054；95%CI：1.013～1.097；P＜0.05）、腰 圍（OR=1.064；95%CI：1.028～1.102；P＜0.05）均為導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的不利因素；該結(jié)論也與其他相關(guān)研究結(jié)論相近[14-15]，結(jié)果提示年齡、腰圍，尤其糖尿病家族史對(duì)T2DM預(yù)防和控制有積極意義。

T2DM的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。目前認(rèn)為T(mén)2DM是由胰島素抵抗與胰島素分泌不足的雙重缺陷共同作用所導(dǎo)致[16]。有研究顯示T2DM過(guò)程中存在糖代謝、脂肪代謝以及線(xiàn)粒體能量代謝等多系統(tǒng)和多通路代謝異常。Brons等[17]的研究表明高脂肪的攝入會(huì)誘導(dǎo)胰島素抵抗及增加PPARGC1基因的DNA甲基化程度，提示T2DM過(guò)程中存在脂肪代謝異常。Jiang等[18]的研究則提示T2DM過(guò)程可能涉及糖代謝異常。因此，探索該過(guò)程中的效應(yīng)分子，進(jìn)一步揭示T2DM的發(fā)病機(jī)制，有利于在T2DM的預(yù)防和治療領(lǐng)域?yàn)槲覀兲峁┬碌膯l(fā)。PPARGC1因其能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝和線(xiàn)粒體能量代謝，進(jìn)而損傷胰島β細(xì)胞，使葡萄糖刺激的胰島素分泌減少而參與T2DM的發(fā)生過(guò)程，受到廣泛關(guān)注。本研究采用重亞硫酸鹽修飾測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PPARGC1基因甲基化水平。該技術(shù)既可以明確甲基化的確切位置，也可以檢測(cè)甲基化的程度，是目前公認(rèn)的DNA樣品甲基化檢測(cè)的推薦方法[19]。PPARGC1基因啟動(dòng)子甲基化在糖尿病發(fā)生中具有重要作用，甲基化水平與糖尿病患病呈低度正相關(guān)，之前有研究表明PPARGC1啟動(dòng)子C等位基因多態(tài)性與T2DM發(fā)病微弱關(guān)聯(lián)[20]。

PPARGC1最早作為調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARγ）的輔激活因子被發(fā)現(xiàn)，其后相繼發(fā)現(xiàn)了其對(duì)下游靶轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的生物學(xué)功能。目前國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)為PPARGC1基因是T2DM中的關(guān)鍵候選基因，因其在人體能量代謝的調(diào)節(jié)中起核心作用，PPARGC1啟動(dòng)子的甲基化會(huì)影響其分子的正常表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致T2DM癥狀。因此，闡明PPARGC1啟動(dòng)子甲基化與T2DM的關(guān)系，有望為胰島素抵抗T2DM的治療提供思路。