牛 犖,田菁燕，李佳琛，李卓成

(1.廣州醫(yī)科大學，廣東廣州 510180；2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學科，廣東深圳 518001；3.深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518035)

輔助生殖技術(ART)實施過程中，獲得高發(fā)育潛能的成熟卵母細胞，進一步培養(yǎng)成優(yōu)質(zhì)胚胎是提高ART臨床妊娠率的關鍵，也是近年來生殖醫(yī)學領域亟待解決的關鍵問題之一[1-2]。相比于外周血，卵泡液作為卵母細胞的賴以生存的微環(huán)境，更能直接影響卵母細胞的生長發(fā)育過程、受精能力及發(fā)育潛能[3]。因此卵泡液微環(huán)境中與卵子發(fā)育有關的激素和細胞因子的調(diào)控作用越來越受到生殖醫(yī)學界的普遍關注[4]。現(xiàn)有研究顯示了外周血人絨毛膜促性腺激素(hCG)、抗苗勒管激素(AMH)與評估卵巢儲備能力及超促排卵過程中的動態(tài)變化與妊娠結(jié)局間的關系[5-7]，而卵泡液中hCG、AMH 濃度與體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中各項指標及妊娠結(jié)局間相關性的研究較少。本研究將卵泡液中hCG、AMH 濃度與IVF-ET各參數(shù)及助孕結(jié)局進行分析，旨在研究卵泡液中hCG、AMH濃度與IVF-ET結(jié)局的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年8-11月深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學科接受IVF-ET助孕的不孕癥患者162例作為研究對象。年齡25～48歲，平均(35.37±4.96)歲，其中原發(fā)性不孕61例，繼發(fā)性不孕101例，不孕年限1～10年。162例不孕癥患者根據(jù)是否獲卵分為未獲卵組29例和獲卵組133例，其中有103例患者接受了卵裂期新鮮移植，根據(jù)103例患者是否獲得臨床妊娠分為妊娠組53例與未妊娠組50例。另外將這103份卵泡液又按照hCG濃度分為hCG<25.0 mIU/mL(A組)、hCG25.0～37.0 mIU/mL(B組)、hCG>37.0 mIU/mL(C組)。納入標準：(1)平素月經(jīng)周期基本規(guī)律，基礎內(nèi)分泌水平及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)正常；(2)6個月內(nèi)無激素應用史、免疫治療史；(3)B超監(jiān)測排卵功能正常，子宮及雙側(cè)附件無器質(zhì)性病變。排除標準：(1)多囊卵巢綜合征；(2)子宮內(nèi)膜異位癥；(3)合并其他影響內(nèi)分泌水平的內(nèi)、外科疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查并討論通過，在充分知情的基礎上獲得患者知情同意書。

1.2方法

1.2.1取卵、受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植 B超引導下通過連續(xù)吸引的負壓裝置吸取卵泡液，并立即在顯微鏡下將卵子移到含胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中放置于37 ℃的三氣孵箱內(nèi)培養(yǎng)。取卵后4 h行短時體外受精。接受鮮胚移植的患者培養(yǎng)第3天擇優(yōu)選擇1～3枚胚胎予以移植，如有胚胎剩余，根據(jù)胚胎情況選擇囊胚培養(yǎng)或者玻璃化凍存胚胎。優(yōu)質(zhì)胚胎的標準由本中心IVF實驗室制定并寫入標準操作程序：常規(guī)IVF/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術 (ICSI)受精,培養(yǎng)至第3天的胚胎細胞數(shù)6～10個，均等性良好，碎片含量≤10%。

1.2.2采集卵泡液 B超引導下經(jīng)陰道逐個穿刺目標卵泡采集卵泡液并立即送至實驗室撿拾卵子，按照如下標準收集卵泡液：(1)卵泡液未被沖卵液及血液污染；(2)卵泡直徑≥15 mm；(3)穿刺所得的卵泡液中的卵冠丘復合體(OCCC)達到Ⅲ級及以上。統(tǒng)一將收集好的卵泡液離心處理，速度為3 000 r/min，離心時間為10 min，去除殘存的纖維蛋白和細胞類物質(zhì)，取上清液放置于經(jīng)高壓滅菌的EP管中，-80 ℃凍存待檢，每份樣本僅可解凍1次。

1.2.3檢測方法 檢測卵泡液中的hCG、AMH濃度采用化學發(fā)光免疫分析法。整個檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行。hCG檢測限為0.6 mIU/mL，AMH的線性范圍0.10～16.00 ng/mL。

1.4觀察指標 患者年齡、卵泡液中hCG、AMH濃度和獲卵數(shù)、卵子成熟度(MⅡ卵率)、兩原核(2PN)率、2PN優(yōu)質(zhì)胚胎率，以及臨床妊娠率。

1.5臨床妊娠判斷標準 接受卵裂期新鮮胚胎移植的患者從取卵日開始行黃體支持，胚胎移植后15 d檢測血hCG>100 mIU/mL即為生化妊娠，移植后30 d陰道B超提示宮腔內(nèi)可見孕囊即判斷為臨床妊娠。

2 結(jié) 果

2.1獲卵組與未獲卵組卵泡液中hCG、AMH濃度比較 獲卵組與未獲卵組卵泡液中的hCG、AMH濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2妊娠組與未妊娠組不同指標間比較 根據(jù)103例接受卵裂期新鮮胚胎移植的患者是否獲得臨床妊娠分為妊娠組53例，未妊娠組50例。兩組2PN率、2PN優(yōu)質(zhì)胚胎率及卵泡液hCG濃度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而兩組年齡、獲卵數(shù)、MⅡ卵率及卵泡液AMH濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 獲卵組與未獲卵組卵泡液中hCG、AMH濃度比較±s)

表2 妊娠組與未妊娠組不同指標間比較±s)

2.3各卵泡液hCG濃度組相關指標比較 鑒于妊娠組與未妊娠組卵泡液hCG濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步將接受鮮胚移植的103份卵泡液根據(jù)hCG濃度分為3組，兩兩一組進行χ2檢驗對比各項指標顯示，A、B、C組的MⅡ卵率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C組2PN率高于A、B兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組的2PN優(yōu)質(zhì)胚胎率低于B、C兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組的臨床妊娠率優(yōu)于A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各卵泡液hCG濃度組相關指標比較[%(n/n)]

注：*P<0.05，與C組比較；#P<0.05，與A組比較

3 討 論

作為卵母細胞賴以生存發(fā)育的微環(huán)境,卵泡液主要由血漿滲透液及卵巢局部產(chǎn)生的某些物質(zhì)組成,其內(nèi)含有許多對卵母細胞發(fā)育潛能和受精能力有重要影響的激素和生物活性因子。在ART過程中，如何獲得高質(zhì)量的成熟卵母細胞并進一步受精發(fā)育為高質(zhì)量的胚胎是取得良好妊娠結(jié)局的重要保證。正確掌握注射hCG的時機和劑量是獲取高質(zhì)量卵子的關鍵。AMH對卵泡的生長發(fā)育有著重要意義[8]，研究顯示卵泡內(nèi)產(chǎn)生的高濃度AMH對正常排卵有著至關重要的作用，而對于排卵前卵泡液AMH濃度與胚胎發(fā)育潛能之間的關系仍存在爭議[9-11]。另外，AMH還能對促排卵階段的卵巢反應情況有一定的預測作用，有助于識別有潛在卵巢過度刺激綜合征風險的女性，為臨床醫(yī)生判斷和調(diào)整促排卵藥物的用量提供依據(jù)。值得一提的是，多囊卵巢綜合征因其在促排卵過程中易發(fā)生卵巢過度刺激或低反應而成為臨床工作的難點，陳雅等[12]推測，多囊卵巢綜合征患者卵泡液AMH濃度可能與卵泡發(fā)育存在相關性。

在促排卵治療過程中，hCG有LH樣作用可以促進卵泡成熟進而誘導排卵。研究顯示體內(nèi)注射hCG有助于提高卵母細胞胞核成熟的效率[13]，卵母細胞的細胞核和細胞質(zhì)發(fā)育同步化與卵母細胞的受精能力、發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局直接相關[14]。取卵前hCG通常的注射方式是肌肉注射給藥，由于卵巢血供豐富，藥物入血后通過卵巢進入卵泡液，所以說與顆粒細胞和卵母細胞生長發(fā)育最息息相關的微環(huán)境是卵泡液。研究顯示[15]，當卵泡液hCG濃度在14～21 nmol/L時，有利于提高卵母細胞成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率，從而提高臨床妊娠率，并推測其機制可能為適宜的hCG濃度促進了卵母細胞質(zhì)和細胞核的發(fā)育同步化，使卵母細胞的受精能力、發(fā)育潛能及臨床妊娠率得到提高。

本研究未獲卵組的卵泡液hCG濃度低于獲卵組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，研究結(jié)果顯示取卵前按時按量的注射hCG是成功獲卵的重要保證。鑒于妊娠組與未妊娠組的卵泡液hCG濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步將所有接受新鮮胚胎移植的患者分為3個hCG濃度組(A、B、C組)，C組的各項參數(shù)及助孕結(jié)局相對較好。說明在合適的范圍內(nèi)，hCG濃度高的各項指標和妊娠結(jié)局較好。但是hCG濃度絕不是越高越好，hCG高濃度長時間的使用可能使IVF周期所獲卵母細胞的受精能力和發(fā)育潛能降低，增加胚胎著床失敗及早期流產(chǎn)的風險，易導致多胎妊娠的發(fā)生率增加，甚至誘發(fā)重度卵巢過度刺激綜合征而危及患者生命，由此可見hCG發(fā)揮生物學效應具有較嚴格的濃度依賴性。本研究有待于繼續(xù)擴大樣本量，深入研究探討hCG濃度的合適范圍，根據(jù)卵巢儲備和反應程度制定個性化合理化的hCG使用劑量，降低輔助生育技術并發(fā)癥的同時又不影響一定數(shù)量高發(fā)育潛能的卵母細胞的獲取。

隨著年齡的增加，卵巢儲備功能及卵母細胞質(zhì)量明顯下降，輔助生育技術的成功率明顯下降，很多卵巢儲備功能不足的高齡患者不得不承受獲卵失敗、無可用胚胎的痛苦。另一方面，在促排卵前評價卵巢儲備功能有助于選擇合理的促排卵方案，個性化調(diào)整用藥劑量和時間，提高用藥安全。陳藝等[16]的研究表明，卵泡液AMH一定程度上能夠較好地預測年輕患者IVF-ET的臨床結(jié)局。本研究未獲卵組的卵泡液AMH濃度低于獲卵組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？梢酝茢喑雎雅菀褐蠥MH濃度偏低與獲卵失敗之間有直接關系，對于高齡、卵泡數(shù)量少、卵巢反應性差及有不良獲卵史的患者，有必要在取卵日留取卵泡液用于檢測AMH濃度來追溯和評估獲卵失敗的原因，為制定后續(xù)的治療方案提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

卵泡液中hCG濃度與IVF-ET妊娠結(jié)局有相關性,卵泡液AMH濃度與獲卵與否有直接關系，可以用于評估卵巢儲備、追溯獲卵失敗的原因，這些都為卵泡液hCG、AMH濃度與IVF-ET妊娠結(jié)局的相關性研究提供了新的思路。但本研究也存在檢測AMH的卵泡液并非來自單個優(yōu)勢卵泡，無法對該卵泡液中的卵母細胞進行進一步觀察，以及由于條件限制導致樣本量較小等不足之處?？偠灾?，卵泡液hCG、AMH濃度與IVF-ET妊娠結(jié)局的關系尚需擴大樣本量進一步深入研究證實。