岳小利，任宗明，李 莉，伏 俊

(1.廣元市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川廣元 628000；2.廣元市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川廣元 628000)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)是一種好發(fā)于兒童和青少年的自身免疫性出血疾病[1]。該病的發(fā)病是由于不明原因的血小板生成減少和破壞增加，導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)減少[2-3]。臨床主要以皮膚黏膜出血為主，甚至出現(xiàn)顱內(nèi)出血導(dǎo)致死亡。對(duì)于ITP的診斷尚無特異性指標(biāo)，主要依靠患者臨床體征和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查，其中血小板抗體和T細(xì)胞亞群檢測(cè)是常用的實(shí)驗(yàn)室檢查手段[4-6]。本研究以廣元市第二人民醫(yī)院收治的ITP患者為研究對(duì)象，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板抗體和T細(xì)胞亞群水平，探討其在疾病診斷中的價(jià)值，從而更好地指導(dǎo)臨床工作。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年3月至2018年5月廣元市第二人民醫(yī)院收治的143例免疫性血小板減少癥患者的臨床資料。其中ITP患者93例，繼發(fā)免疫性血小板減少癥(sITP)患者50例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合第8版《內(nèi)科學(xué)》有關(guān)免疫性血小板減少癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期使用過激素或免疫抑制劑；凝血功能障礙；妊娠或哺乳期婦女。選取同期在廣元市第二人民醫(yī)院體檢的健康志愿者50例為對(duì)照組。ITP組男39例，女54例；年齡2～30歲，平均(16.5±9.5)歲。sITP組男31例，女19例；年齡2～29歲，平均(17.1±10.1)歲。對(duì)照組男29例，女21例；年齡2～29歲，平均(16.1±10.4)歲。3組性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有均衡可比性。

1.2方法

1.2.1血小板抗體檢測(cè) 采集清晨空腹肘靜脈血2 mL，置入含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的真空采血管，800 r/min離心15 min，分離血漿。將所得血漿轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管，2 000 r/min離心5 min，分離血小板。將所得血小板轉(zhuǎn)移至另一根流式細(xì)胞管，加入磷酸鹽緩沖液洗滌血小板，2 000 r/min離心5 min，分離血小板，如此重復(fù)3次。最后用磷酸鹽緩沖液將所獲得的血小板稀釋至5×109/L，分別加入3支流式細(xì)胞管，每管100 μL。每管加入20 μL的CD41抗體，再分別加入血小板抗體(PAIgG、PAIgM、PAIgA)各20 μL。混勻器混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。每管加入磷酸鹽緩沖液洗滌，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，再各自加入500 μL磷酸鹽緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2T細(xì)胞亞群檢測(cè) 血樣采集和抗凝處理同1.2.1。將抗凝后的全血分別加入2支流式細(xì)胞管，每管100 μL。每管加CD3+/CD8+/CD45+/CD4+抗體各20 μL。混勻器混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。每管再分別加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液，室溫避光反應(yīng)15 min。1 000 r/min離心5 min，棄去上清，每管再各自加入500 μL磷酸鹽緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1各組血小板抗體和T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較 方差分析結(jié)果顯示，3組血小板抗體和T細(xì)胞亞群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)兩兩比較顯示，ITP組患者PAIgG、PAIgM、PAIgA均明顯高于sITP組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ITP組患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯低于sITP組和對(duì)照組，而CD8+水平明顯高于sITP組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組血小板抗體和T細(xì)胞亞群異常情況比較 ITP組患者PAIgG、PAIgM、PAIgA異常率均明顯高于sITP組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ITP組患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+異常率均明顯高于sITP組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組血小板抗體和T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較±s)

表2 各組血小板抗體和T細(xì)胞亞群異常情況比較[n(%)]

2.3血小板抗體和T細(xì)胞亞群診斷ITP的作用 血小板抗體聯(lián)合T細(xì)胞亞群診斷ITP的ROC曲線下面積(AUC)為0.932，靈敏度為86.5%，特異度為87.5%，均優(yōu)于單獨(dú)診斷。見表3。

表3 血小板抗體和T細(xì)胞亞群診斷ITP的作用

3 討 論

臨床能夠引起血小板計(jì)數(shù)減少的原因很多，如白血病、自身免疫病、腫瘤、再生障礙性貧血、感染、Evans綜合征等都有可能引起血小板計(jì)數(shù)減少，這一類稱之為sITP[7-8]。目前對(duì)于ITP的診斷尚無特異性指標(biāo)，診斷也主要為排他性診斷，依靠患者臨床體征和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查，并排除sITP之后，對(duì)于不明原因所致的血小板減少可診斷為ITP。

對(duì)于ITP的發(fā)病機(jī)制目前尚無明確定論，大量研究顯示體液免疫和細(xì)胞免疫參與了ITP的發(fā)病，因?yàn)樵贗TP患者中可觀察到顯著的免疫功能異常改變，主要表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞活化[9-10]。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要成分，在抗原刺激時(shí)能夠活化并分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子，以參與免疫調(diào)節(jié)功能。其中CD3+、CD4+是最主要的誘導(dǎo)和輔助免疫細(xì)胞，能夠增強(qiáng)和擴(kuò)大其他免疫細(xì)胞功能，CD8+又稱為抑制性T細(xì)胞，主要平衡CD3+和CD4+功能。有研究顯示[11]，ITP患者CD8+水平增加，能夠直接破壞被抗體包被的血小板，并抑制骨髓中衰老巨核細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致血小板生成減少。B細(xì)胞產(chǎn)生抗血小板抗體，加強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬，導(dǎo)致外周血血小板清除增加。有研究顯示[12],患者全血血小板計(jì)數(shù)與抗血小板抗體成明顯的負(fù)相關(guān)，也證實(shí)了抗血小板抗體增加是導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)減少的重要原因。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板抗體和T細(xì)胞亞群的水平變化，流式細(xì)胞儀具有檢測(cè)便捷、快速等特點(diǎn)，而且所需樣本量少，大大減少了工作量，縮短了檢測(cè)時(shí)間。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITP組患者PAIgG、PAIgM、PAIgA均明顯高于sITP組和對(duì)照組，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯低于sITP組和對(duì)照組，而CD8+水平明顯高于sITP組和對(duì)照組。結(jié)果表明ITP患者血小板抗體水平顯著升高，T細(xì)胞亞群比例失調(diào)。這與彭征等[13]、張雪等[14]學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。提示血小板抗體升高和T細(xì)胞亞群紊亂參與了疾病的發(fā)病，而對(duì)于此二者的檢測(cè)有利于臨床對(duì)ITP的診斷。本研究進(jìn)一步采用ROC曲線評(píng)價(jià)血小板抗體和T細(xì)胞亞群診斷ITP的作用，結(jié)果顯示，聯(lián)合診斷的AUC面積和靈敏度均優(yōu)于單獨(dú)診斷，提示血小板抗體聯(lián)合T細(xì)胞亞群對(duì)于ITP具有較高的診斷效能。

4 結(jié) 論

ITP患者存在血小板抗體升高和T細(xì)胞亞群紊亂的現(xiàn)象，這可能與疾病的發(fā)病相關(guān)。聯(lián)合檢測(cè)血小板抗體和T細(xì)胞亞群能夠更加準(zhǔn)確地反映患者病情，提高診斷的效能，為疾病的臨床治療提供更好的支持。