夏 斌，王芙蓉，嚴(yán)茹紅，朱紅楠，蔡培培△

(1.蘇州科技城醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215153；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215153)

宮頸癌是現(xiàn)代女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)每年都有將近50萬(wàn)人新患宮頸癌，我國(guó)宮頸癌患病率就占了25%[1-5]，研究發(fā)現(xiàn)99%以上的宮頸癌都能夠找到人乳頭瘤病毒(HPV)感染的跡象，這些感染中主要型別是HPV16(約占53%)和HPV18(約占15%)[6-9]，HPV不能在體外經(jīng)組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，相應(yīng)的抗原及抗體來(lái)源相對(duì)缺乏，使得有關(guān)HPV血清學(xué)檢測(cè)方法的研究也因此相對(duì)比較滯后[10]，本研究利用蛋白原核表達(dá)和細(xì)胞融合技術(shù)制備HPV16E6、18E6特異性單克隆抗體，對(duì)HPV16、HPV18型別感染者的快速檢測(cè)和診斷打下物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6工程菌株由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；本實(shí)驗(yàn)室自備SP2/0細(xì)胞株；SPF級(jí)BALB/C小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2儀器與試劑 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)劑、次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培養(yǎng)基、次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT)培養(yǎng)基、融合誘導(dǎo)劑PEG4000由美國(guó)MERK公司提供；卡那霉素由上海生工生物工程公司提供；小鼠抗His-Tag單克隆抗體、弗氏完全佐劑和不完全佐劑由美國(guó)Sigma公司提供；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素由美國(guó)Hiclone公司提供； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒由碧云天公司提供；HPV E6、HPV16E6、18E6蛋白由上海滬震實(shí)業(yè)有限公司提供；HR40-Ⅱ A2生物安全柜由青島海爾特種電器有限公司提供；MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱由三洋電機(jī)株式會(huì)社提供；超聲破碎儀JY-250由浙江省三門(mén)超聲波儀器廠提供；JS POWER-300電泳儀由上海培清科技有限公司提供；羊抗鼠IgG-HRP、Mulitskan MK3酶標(biāo)儀由賽默飛世爾科技公司提供；96孔酶標(biāo)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板由美國(guó)Corning公司提供；His Trap FF親和層析柱購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3HPV16E6、18E6蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及定量

1.3.1HPV16E6、18E6基因誘導(dǎo)表達(dá) BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6工程菌株在瓊脂平板(含卡那霉素50 μg/mL)涂板活化后挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素 50 μg/mL)培養(yǎng)過(guò)夜，之后取菌液1∶100稀釋作擴(kuò)增培養(yǎng)至OD值為1.0，以終濃度為0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜后收集菌液。誘導(dǎo)產(chǎn)物作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析,以稀釋度為1∶2 000的小鼠抗His-Tag單克隆抗體作為一抗，稀釋度為1∶2 000的羊抗鼠IgG-HRP為二抗作蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)鑒定。

1.3.2HPV16E6、18E6重組蛋白的純化及定量 收集誘導(dǎo)后菌液離心取沉淀，超聲破碎菌體，取超聲破碎后懸液的上清和沉淀同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，觀察是否在20×103、22×103的位置出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，以確定重組蛋白以可溶性形式存在于超聲裂解上清中。按照His Trap FF親和層析柱使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化操作，對(duì)純化前和純化后的產(chǎn)物分別進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，分析純化效果。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)純化后蛋白進(jìn)行定量分析。

1.4HPV16E6、18E6蛋白單克隆抗體制備及其鑒定 以純化的HPV16E6、18E6重組蛋白為免疫原免疫6～8周的BALB/c 小鼠。以HPV16E6、18E6蛋白作為抗原分別包被96孔酶標(biāo)板，1∶10 000稀釋度的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 法測(cè)定BALB/c 小鼠血清抗體效價(jià)；以HPV E6抗原包被96孔酶標(biāo)板，1∶10 000稀釋度的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗間接ELISA 法測(cè)定BALB/c 小鼠血清腹腔積液效價(jià)。取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞作細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。采用以HPV16E6、18E6抗原分別包被96孔酶標(biāo)板，1∶10 000稀釋度的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗間接ELISA 法篩選融合的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行單克隆增殖培養(yǎng)，以獲取可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。Western blot對(duì)單克隆抗體進(jìn)行鑒定，提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，以抗His-Tag單克隆抗體作為一抗、羊抗鼠IgG-HRP為二抗，按照產(chǎn)品書(shū)進(jìn)行孵育，ECL顯色液顯色。分析觀察是否在20×103、22×103位置出現(xiàn)特異性條帶。

2 結(jié) 果

2.1HPV16E6、18E6重組蛋白表達(dá)、純化及定量結(jié)果 BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6 誘導(dǎo)和純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1，在誘導(dǎo)后出現(xiàn)相對(duì)高濃度的蛋白條帶，并伴有雜帶，在純化后雜帶消失。將IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行 Western blot鑒定，結(jié)果顯示，與BL21相比，HPV16E6、18E6在20×103、22×103處有明顯條帶，說(shuō)明所誘導(dǎo)的表達(dá)蛋白即為目的蛋白，見(jiàn)圖2。對(duì)所獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃度測(cè)定，測(cè)得吸光度為0.650，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室繪制的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度測(cè)定曲線，計(jì)算得出目的蛋白濃度為0.25 mg/mL。見(jiàn)圖3。

2.2HPV16E6、18E6蛋白單克隆抗體制備及其鑒定結(jié)果 血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果顯示HPV16E6 免疫后小鼠血清1∶16 000 稀釋后高達(dá)1.219，見(jiàn)表1。

2.2.1腹腔積液效價(jià)測(cè)定 間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，腹腔積液在作1∶512 000稀釋后OD值仍高達(dá)0.937，效價(jià)高達(dá)106。

注：M為DNA標(biāo)記物； 1為BL21 未誘導(dǎo)； 2為BL21誘導(dǎo)后；3為BL21-PET28a-16E6未誘導(dǎo)；4為BL21-PET28a-18E6未誘導(dǎo)；5為BL21-PET28a-16E6誘導(dǎo)后；6為BL21-PET28a-18E6誘導(dǎo)后；7為HPV 16E6純化后；8為HPV 18E6純化后

圖1誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳分析

2.2.2細(xì)胞融合后陽(yáng)性克隆篩選 脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后經(jīng)篩選共得到3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。其中兩株可分泌抗HPV16 抗體，分別命名為HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2；1株可分泌抗HPV18 抗體，命名為HPV18E6-3-H1，其中中間數(shù)字代表96孔板序號(hào)，后字母加數(shù)字代表在96孔板的位置，細(xì)胞培養(yǎng)液吸光度(A450，參考波長(zhǎng)630 nm)分別為0.995、1.003、1.012。

2.2.3陽(yáng)性克隆鑒定 以BL21、BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6為抗原，收集雜交瘤細(xì)胞HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2、HPV18E6-3-H1培養(yǎng)液為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot,結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2分泌抗體可特異性與HPV16E6結(jié)合，見(jiàn)圖4，HPV18E6-3-H1分泌抗體可特異性與HPV18E6結(jié)合，見(jiàn)圖5。

注：M為DNA標(biāo)記物；1為BL21；2為HPV16E6；3為HPV18E6

圖2 HPV16E6、HPV18E6 Western blot鑒定

圖3 HPV16E6、18E6蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白類(lèi)型1∶2 0001∶4 0001∶8 0001∶16 0001∶32 0001∶64 000空白對(duì)照HPV16E62.2901.7621.5001.0110.5530.3230.063HPV18E62.1231.7811.2190.7470.4670.2630.066

注：M為DNA標(biāo)記物；1為BL21；2為BL21-PET28a-16E6(HPV16E6-2-G9)；3為BL21-PET28a-16E6(HPV16E6-2-F2)

圖4抗HPV16E6單克隆Western blot鑒定

注：M為DNA標(biāo)記物； 1為BL21； 2為HPV18E6(HPV18E6-3-H1第1次) ； 3為HPV18E6(HPV18E6-3-H1第2次)

圖5抗HPV18E6單克隆Western blot鑒定

3 討 論

在HPV感染患者中，亞型發(fā)生率最高的是HPV16型和HPV18型，這也是我國(guó)婦女宮頸癌的主要型別[11-12]。因此，加強(qiáng)對(duì)HPV16型和18型感染的檢測(cè)對(duì)宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)和早治療具有極其重要的意義。一方面HPV的血清學(xué)研究對(duì)HPV流行病學(xué)研究具有重要價(jià)值，但另一方面由于條件限制現(xiàn)在還沒(méi)有體外培養(yǎng)HPV的合適方法,所以很難要獲得足夠的HPV天然抗原作為研究材料。原核表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)量高、費(fèi)用低廉方面的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度，控制誘導(dǎo)前細(xì)菌的濃度、降低誘導(dǎo)時(shí)轉(zhuǎn)速和減少誘導(dǎo)時(shí)間可以明顯促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)[13]，同時(shí)His標(biāo)簽不但不會(huì)使重組蛋白的生物學(xué)活性受到影響，而且還使得蛋白質(zhì)的純化和檢測(cè)步驟更方便。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)預(yù)先構(gòu)建的BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a- 18E6轉(zhuǎn)化菌原核表達(dá)獲得了大量的HPV16E6、18E6蛋白，經(jīng)Western blot鑒定，證實(shí)了目的蛋白即是研究者所需要的蛋白。純化的HPV16 E6、18E6融合蛋白作為免疫原免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞作細(xì)胞融合，作單克隆培養(yǎng)，有限稀釋篩選出2株分泌抗HPV16 E6及1株分泌抗HPV18E6的抗體，分別命名為HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2、HPV18E6-3-H1。Western blot 檢測(cè)所篩選到的抗體，結(jié)果顯示HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2只與HPV16型的E6蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，確認(rèn)是抗HPV16 E6特異性單克隆抗體。 同樣，HPV18E6-3-H1只與 HPV18型的E6蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，確認(rèn)是抗HPV18 E6特異性單克隆抗體。通過(guò)制備小鼠腹腔積液，本實(shí)驗(yàn)成功地獲得了大量的HPV16E6、18E6特異性單克隆抗體，腹腔積液檢測(cè)顯示出極高的效價(jià)，免疫結(jié)果良好。不僅為今后進(jìn)一步研究HPV16、HPV18的致癌機(jī)制，提供了一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)資源，而且對(duì)HPV16、HPV18感染者的快速檢測(cè)和治療將具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

成功制備抗HPV16E6、18E6單克隆抗體，該抗體效價(jià)高，特異度好，為建立血清學(xué)診斷方法打下了基礎(chǔ)。