田菁菁,王 敏,李先平

(中南大學湘雅二醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410011)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMO)是骨質(zhì)疏松最常見的類型，骨保護素(OPG)又稱破骨細胞形成抑制因子[1-2]。雌激素可通過增加骨中OPG的表達，抑制破骨性骨吸收，對去卵巢的骨質(zhì)疏松有明顯的治療作用。以往針對雌激素抗骨質(zhì)疏松情況的研究絕大多數(shù)以去卵巢小鼠為實驗對象[3-5]，而少以健康小鼠作為研究對象。本實驗旨在統(tǒng)計注射雌激素后小鼠體內(nèi)OPG及骨代謝相關(guān)生化指標的變化情況及其相關(guān)性，以探討其在骨質(zhì)疏松中的意義，為骨質(zhì)疏松的診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 2018年3-4月42只無特定病原體(SPF)級美國癌癥研究所(ICR)雌鼠，均購自湖南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心[SCXK(湘)2014-0001]，6周齡，平均體質(zhì)量(22±2)克。實驗前全部小鼠于SPF級環(huán)境分籠內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃，相對濕度60%左右，照明12 h明亮，12 h黑暗，換氣次數(shù)每小時18次，動物飼養(yǎng)籠具、飲水瓶定期消毒，所用墊料高壓滅菌，飼養(yǎng)房內(nèi)定期紫外燈消毒。喂食普通飲食，成分為6.5%脂肪、56%碳水化合物(2.5%糖)。

1.2儀器與試劑 應(yīng)用雅培C8000全自動生化分析儀由雅培貿(mào)易(上海)有限公司提供；小鼠OPG ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，產(chǎn)品編號：EK0481。苯甲酸雌二醇注射液購自天津金耀氨基酸有限公司，國藥準字H12020529，規(guī)格為1 mL∶1 mg。

1.3方法

1.3.1動物處理 取42只6周齡的ICR小鼠，分成A、B、C、D、E、F、G組，每組6只。實驗前全部小鼠飼養(yǎng)與SPF級環(huán)境內(nèi)。除G組(對照組)外，其余實驗組(A～F組)小鼠每只注射0.5 mL的雌激素。分別在注射雌激素的第1、3、4、7、14和21天使用頸椎脫臼法處死,第1天即為當天；于注射雌激素前1天使用頸椎脫臼法處死G組小鼠。

1.3.2血清收集 A組小鼠在注射雌激素的當天行眼球取血，將采好的血于在37 ℃溫箱保存2 h后在4 ℃冰箱內(nèi)放置1 h，2 500×g離心10 min，分離并收集血清，儲存于-20 ℃。B、C、D、E、F組分別在動物處死當天采用同樣方法進行處理。G組于注射雌激素前1天收集血清并于-20 ℃保存。

1.3.3血清OPG的測定 室溫溶解凍存血清，所有血清樣本均使用樣本稀釋液對倍稀釋；采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定血清OPG；以吸光度值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標，使用各水平標準品(6 000、3 000、1 500、750、375、187．5、93．8 pg/mL)，繪制標準曲線圖，并根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應(yīng)的濃度。

2 結(jié) 果

2.1OPG濃度標準曲線的制作 由ELISA法測出的標準濃度的數(shù)值用Excel做出標準曲線，所得曲線方程為Y=0.000 4X+0.164 1，相關(guān)系數(shù)為0.961 2，其中X為OPG的濃度,Y為測得的吸光度值。見圖1。

圖1 OPG濃度標準曲線圖

2.2血清OPG含量比較 由得到的標準方程計算出各實驗小鼠血清中的OPG濃度，其中對照組小鼠(G組)OPG水平為(3.540±0.65)ng/mL(P=1.000)。與健康小鼠相比，注射過雌激素的小鼠在剛注射雌激素后4 d內(nèi)所取血清中OPG含量有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第4天以后的含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組A～F組分別對應(yīng)注射雌激素后第1、3、4、7、14和21天小鼠的OPG水平分別為(7.903±1.94)ng/mL(P=0.000)、(8.629±1.57)ng/mL(P=0.000)、(6.299±1.09)ng/mL(P=0.017)、(5.460±1.49)ng/mL(P=0.075)、(5.080±2.81)ng/mL(P=0.149)及(3.951±1.38)ng/mL(P=0.709)。每組小鼠與健康小鼠比均有增高，在第3天達到最高值。

2.3注射雌激素后各生化指標比較 與健康小鼠比較，各實驗組小鼠血清中GGT含量和A、B、C組ALP含量明顯升高，其中各實驗組小鼠與對照組小鼠GGT比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);而A、B、C組ALP水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036、0.008、0.002)。D、E、F組的ALP谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、鈣(CA)、磷(P)和鎂(MG)的水平變化比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。而各實驗組間比較結(jié)果表明，除了A組與D組的ALT比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)外，其他組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4OPG、γ-GT及ALP的相關(guān)性分析 由圖2～4可知，OPG、γ-GT和ALP之間存在正相關(guān)的趨勢，故本實驗采用SPSS13.0對這3個指標進行相關(guān)分析。結(jié)果顯示OPG與ALP的相關(guān)系數(shù)為0.99，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，OPG的含量和GGT的相關(guān)系數(shù)為0.498，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.255)，GGT與ALP的相關(guān)系數(shù)為0.528，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.223)，見表1。

圖2 各組OPG的均值曲線

圖3 各組γ-GT的均值曲線

圖4 各組ALP的均值曲線

項目OPGGGTALPOPG Pearson 相關(guān)性10.4980.993?? 顯著性(雙側(cè))-0.2550.000 GGT Pearson 相關(guān)性0.49810.528 顯著性(雙側(cè))0.255-0.223 ALP Pearson 相關(guān)性0.993??0.5281 顯著性(雙側(cè))0.0000.223-

注：**表示在 0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；-表示無數(shù)據(jù)

3 討 論

骨為肌肉收縮提供附著并保護內(nèi)臟，是重要的生命器官。一般認為骨在細胞水平的代謝不活躍，然而事實上骨細胞在不停地進行代謝，不僅骨細胞之間存在相互作用，骨髓中的紅細胞生成細胞及基質(zhì)細胞通過相互作用所構(gòu)建的骨骼微環(huán)境，也是機體賴以進行骨的改建和重建的重要基礎(chǔ)[6]。骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，近年來研究認為骨質(zhì)疏松與衰老、雌激素下降、營養(yǎng)失調(diào)、疾病、藥物和遺傳基因等因素有關(guān)[7]，這些因素影響骨量的丟失與骨重建這一過程，當骨吸收大于骨形成時即導致骨質(zhì)疏松[8]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是由于絕經(jīng)女性的卵功能衰退，合成和分泌雌激素的功能下降，從而影響骨鈣吸收，骨量大幅度下降而導致骨質(zhì)疏松[9-10]。

骨量的維持由骨形成作用和骨吸收作用間的動態(tài)耦聯(lián)和平衡完成。除骨細胞本身以外，許多激素及生長因子、細胞因子均參與這些過程的調(diào)控。骨量的丟失與否則取決于骨局部微環(huán)境中的細胞因子和生長因子的濃度及活性。盡管多種細胞因子或激素可以調(diào)控破骨細胞的分化成熟，但研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(TNF)超級家族的成員核因子κB受體活化因子配基(RANKL)和多集落刺激因子(M-CSF)為其決定因素[11]。在存在M-CSF的情況下，破骨細胞的前體細胞表達的核因子κB受體活化因子(RANK)可以和成骨細胞和基質(zhì)細胞表達的RANKL配體結(jié)合，誘導破骨細胞前體細胞分化成破骨細胞;同時成熟的破骨細胞也表達RANK，它也可以與RANKL結(jié)合調(diào)節(jié)成熟破骨細胞的骨吸收活性。成骨細胞系的多種細胞分泌表達OPG，它與RANKL競爭性結(jié)合，阻止RANKL與RANK的結(jié)合，從而阻止破骨細胞活化及抑制骨吸收[12-13]。因此OPG對于骨代謝起著非常重要的作用。部分研究表明，體內(nèi)各種激素和細胞因子包括rhIGF-1[14]和MT3T3-E1[15]等，均可通過影響破骨細胞上的OPG配體進而影響成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞，調(diào)控破骨細胞水平，也從側(cè)面反映了OPG的骨代謝調(diào)節(jié)作用。OPG作為骨代謝調(diào)控的終末因素，缺乏或者受到破壞時，可以出現(xiàn)各種骨代謝方面的異常。

另一方面，大量的基礎(chǔ)研究已肯定了雌激素對骨質(zhì)疏松的保護作用。體外實驗表明,雌激素可刺激成骨細胞株OPG的分泌,阻斷破骨細胞骨吸收信號的傳遞,從而拮抗去卵巢大鼠介導的骨質(zhì)疏松[3]。在雌激素對抗骨質(zhì)疏松相關(guān)機制的研究中，基于OPG的OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)受到關(guān)注。國內(nèi)外研究表明OPG具有抑制破骨細胞形成、分化、存活、活化并誘導破骨細胞凋亡的功能,其功能與RANKL密切相關(guān),因為RANKL 是OPG的配體,OPG與RANKL結(jié)合抑制破骨細胞形成和活化,發(fā)揮抗破骨作用[16-17]。另外有研究表明，雌激素受體β沉默可通過ApoE影響 RANKL 通路和OPG水平，從而影響骨代謝水平[18]；成骨細胞中的雌激素β受體可通過調(diào)控IL-6及TGF-β從而影響RANKL/RANK/OPG通路[19],無不驗證了雌激素水平與OPG水平的相關(guān)性。而絕經(jīng)婦女體內(nèi)雌激素缺乏導致骨中OPG表達量下降，外源性雌激素的應(yīng)用則可阻止這種變化，將是未來治療老年性骨質(zhì)疏松的發(fā)展方向。以往研究大多以敲除卵巢或已患骨質(zhì)疏松的動物為實驗對象研究雌激素對骨代謝的影響作用，而鮮少將健康小鼠作為實驗對象。

因此本實驗利用給健康小鼠注射雌激素后測得血清中OPG的含量和骨代謝的一些生化指標質(zhì)的變化情況，以期探討雌激素對抗骨質(zhì)疏松的作用。各實驗組血清中OPG含量變化情況表明，與對照組比較，注射過雌激素的小鼠在剛注射后4 d內(nèi)取的血清OPG的含量會明顯升高,第3天達到峰值。在第3天以后OPG含量呈緩慢下降趨勢，到達第21天時基本與正常水平持平。引起這種結(jié)果的原因與小鼠的個體差異和雌激素的藥代動力學有關(guān)。從本實驗原始數(shù)據(jù)可知小鼠間的個體差異較大。人體雌激素代謝時間為7～10 d[20]，研究者推斷注射的雌激素在小鼠體內(nèi)有類似或更短的作用時間，即隨著雌激素的代謝，會出現(xiàn)OPG水平的下降。

除了測定上述OPG的結(jié)果以外，本實驗同時測定了實驗小鼠的肝腎功能和骨代謝的相關(guān)生化指標。本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，血清中骨代謝指標GGT、ALP水平明顯升高。而其他肝腎功能的指標水平變化不明顯，即排除是由于肝腎功能變化所致；健康人群的血清或血漿中測得的總ALP 幾乎全部來自肝臟和骨骼系統(tǒng)[20]。血清總ALP不能完全代表其來源，因此常用γ-GT來鑒別ALP的來源[1]。本實驗測定雖為血清總ALP,但由于已排除由肝腎功能變化所致，故可推測本實驗所測得的ALP升高為骨源性升高。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示OPG、γ-GT、ALP的含量均明顯增高且呈正向相關(guān)，進一步說明健康小鼠注射雌激素以后通過影響OPG水平使骨代謝產(chǎn)生變化。本實驗選取健康小鼠而非去卵巢作為實驗對象，更真實地模擬了一般情況下雌激素水平對骨代謝的影響；且短時間后OPG水平的下降也從側(cè)面證明其與雌激素代謝時間的相關(guān)性。后續(xù)試驗將繼續(xù)就健康小鼠中雌激素水平導致OPG水平改變的機制進行研究及驗證。本研究證明雌激素可以通過升高OPG水平從而抑制骨吸收，實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射雌激素能在短期內(nèi)使健康ICR雌鼠血清中的OPG、ALP、GGT等骨代謝相關(guān)指標升高。雌激素對OPG有促進作用，可以通過升高OPG水平從而抑制骨吸收，實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松作用。