丁潔，陳靜，沙芮，牛犇，梁寧

(甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州 730020)

黑豆是豆科植物大豆的黑色種子，作為食藥兩用的作物，具有悠久的歷史[1].古代醫(yī)書中記載的黑豆具有烏發(fā)、補(bǔ)腎、解毒、延年益壽等功效[2].現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)也表明黑豆可烏發(fā)、活血解毒、明目、軟化血管、治療不孕等[3].花色苷在黑豆皮中含量較高[4]，所以黑豆具有自身抵御過氧化的保護(hù)系統(tǒng)、抗衰老、抗逆生理等生理作用，對人體健康有著極大的改善.黑豆種皮因富含色素而呈現(xiàn)黑色并具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降血脂及抗氧化等多種生理活性[5-7].因此黑豆對人體及動物抗衰老、抗氧化、降低肥胖風(fēng)險與消除腫瘤等方面有著重要意義[8-12].

目前黑豆花色苷提取溶劑多見無機(jī)酸，如鹽酸，或酸性醇溶液[13-14].L-蘋果酸(L-malic acid)是生物體糖代謝過程中產(chǎn)生的重要有機(jī)酸，廣泛存在于自然界的水果和蔬菜中，1967年被美國食品和藥品管理局登記確認(rèn)為一種安全、無毒、無害、可食用的有機(jī)酸[15].L-蘋果酸可以緩解體力疲勞，能夠增加機(jī)體的耐力；具有抗氧化活性，能夠捕獲自由基[16].在食品工業(yè)中，L-蘋果酸用做加工和配置飲料、露酒、果汁，是一種良好的食品添加劑和高級飲品調(diào)味劑.L-蘋果酸為天然果汁的重要成份，與檸檬酸相比具有酸度大(酸味比檸檬酸強(qiáng)20%)，但味道柔和(具有較高的緩沖指數(shù))，具特殊香味，不損害口腔與牙齒，代謝上有利于氨基酸吸收，不積累脂肪，是新一代的食品酸味劑，被生物界和營養(yǎng)界譽(yù)為“最理想的食品酸味劑”.鑒于目前尚未見到L-蘋果酸提取黑豆花色苷的相關(guān)報道，本試驗以黑豆皮為原料，研究L-蘋果酸濃度、料液比、溫度、提取時間4個因素對黑豆皮花色苷含量的影響，通過單一pH法計算[17]，運(yùn)用正交試驗法優(yōu)化L-蘋果酸提取黑豆皮花色苷的工藝，旨在為開發(fā)花色苷功能性食品藥品提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

黑豆皮，購自蘭州市場的黑豆浸泡后剝皮晾干，備用；純水自制；L-蘋果酸(德國三顆星食品物料公司)，批號20180819S；XS225A型電子分析天平普利塞斯，瑞士；優(yōu)普UPT-I-20L落地式純水機(jī)四川優(yōu)普超純科技；UV2300Ⅱ型雙光束紫外可見光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮花色苷的提取工藝 準(zhǔn)確稱取干燥粉碎后的黑豆皮2 g，加入一定體積的L-蘋果酸溶液，在一定溫度下加熱，振蕩，抽濾、定容.

1.2.2 花色苷含量的測定將提取液稀釋適宜倍數(shù)，通過紫外分光光度計測定吸光度，參照Fuleki[18]的計算方法計算.

花色苷含量=(A×MW×DF×1 000)/ (ε×1)

其中，A為吸光值；MW為分子量(以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)，449.4)DF為稀釋倍數(shù)；ε為消光系數(shù)，26 900 L/(cm·mg).

1.2.3 單因素試驗 參考翟碩等的方法[4]固定L-蘋果酸溶液濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))30%，黑豆皮與L-蘋果酸溶液料液比1∶20 (g∶mL)、溫度30 ℃、提取60 min的情況下，改變另外的因素水平，L-蘋果酸溶液濃度(g/mL)為5%、10%、20%、30%、40%；料液比(g∶mL)為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40；溫度為20、30、40、50、60 ℃；提取時間為30、60、90、120、150 min；進(jìn)行單因素試驗，以提取率為指標(biāo)，擇優(yōu)參數(shù).

1.2.4 正交試驗設(shè)計 采用SPSS 19.0軟件，在單因素試驗基礎(chǔ)上，依據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)置水平，以L-蘋果酸溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素的3個水平設(shè)計正交試驗L9(34)優(yōu)化L-蘋果酸提取黑豆皮花色苷工藝.

2 結(jié)果與分析

2.2 單因素試驗結(jié)果及分析

2.2.1 L-蘋果酸溶液濃度對黑豆花色苷提取率的影響 由圖1結(jié)果可知，其他條件不變時，黑豆皮花色苷的提取率隨L-蘋果酸溶液濃度的增加而增加.當(dāng)L-蘋果酸溶液濃度達(dá)30%時，提取率最大，與酸濃度5～20 %相比，差異顯著，當(dāng)L-蘋果酸溶液濃度過高花色苷提取率有所降低，由于酸性較強(qiáng)引起花色苷糖水解，導(dǎo)致含量下降.考慮其穩(wěn)定性，防止花色苷水解.因此選擇L-蘋果酸溶液濃度10%～30%為正交試驗因素水平.

2.2.2 料液比對黑豆皮花色苷提取率的影響 由圖4可知，黑豆花色苷提取率隨著料液比的提高呈增加趨勢.當(dāng)料液比<1∶10時，由于溶劑量較少，花色苷溶解不完全，提取率較低，當(dāng)料液比>1∶10時，黑豆花色苷提取率大幅提高，是由于花色苷向提取液擴(kuò)散速率變快，充分溶解，溶解量增大.而當(dāng)料液比繼續(xù)增加，花色苷提取率變化不大，料液比超過1∶30提取率基本不變，說明花色苷溶解速率達(dá)到平衡.當(dāng)料液比繼續(xù)增大，提取率基本不變，從節(jié)約成本角度考慮，料液比選擇1∶10～1∶30為正交試驗因素水平.

圖1 L-蘋果酸濃度對黑豆皮花色苷提取率的影響Figure 1 Effect of L-malic acid concentration on extraction rate of anthocyanins from black soybean peel

圖2 料液比對花色苷提取率影響Figure 2 Effect of material to liquid on extraction rate of anthocyanins

2.2.3 提取溫度對黑豆皮花色苷提取率的影響 由圖3可知，黑豆皮花色苷提取率隨著提取溫度的增長呈上升趨勢.20 ℃到30 ℃提取率上升較緩慢，溫度由30 ℃升至40 ℃時，粗提液中黑豆皮花色苷提取率上升較快最高，40 ℃以后花色苷提取率基本不變，隨著溫度進(jìn)一步升高，超過50 ℃花色苷提取率略有下降.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是隨著溫度升高，花色苷溶出速度加快.由于花色苷是熱敏性色素，溫度進(jìn)一步升高，會破壞已溶出的花色苷結(jié)構(gòu)[15]，部分花色苷發(fā)生分解，綜合降低能耗因素考慮，選擇30～50 ℃為正交試驗因素水平.

圖3 溫度對花色苷吸光度的影響Figure 3 Effect of temperature on extraction rate of anthocyanins

2.2.4 提取時間對黑豆皮花色苷提取率的影響 由圖6可知，隨著提取時間的延長，黑豆皮花色苷提取率呈上升趨勢，在30～90 min內(nèi)花色苷提取率增加較快，提取時間超過90 min花色苷提取率不再上升，說明90 min左右花色苷提取完全.繼續(xù)增加提取時間，花色苷可能被分解.因此，選擇60～120 min為正交試驗因素水平.

圖4 提取時間對花色苷提取率的影響Figure 4 Effect of extraction time on extraction rate of anthocyanins

2.3 正交試驗結(jié)果及分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇4個影響因素的3個水平設(shè)計正交試驗L9(34)優(yōu)化L-蘋果酸提取黑豆皮花色苷工藝，考察指標(biāo)為花色苷提取率，正交試驗因素表，見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3.

由表3可知，L-蘋果酸提取黑豆皮花色苷的影響因素中L-蘋果酸濃度影響顯著，料液比的影響極顯著，溫度和提取時間次之，影響不顯著.極差分析結(jié)果中得出的最佳工藝是A3B3C1D1；即L-蘋果酸濃度為30%，料液比為1∶30，加熱溫度為30 ℃，提取時間為60 min.

2.4 驗證試驗

由于極差分析最優(yōu)工藝與正交試驗結(jié)果最優(yōu)工藝不一致，正交試驗最優(yōu)工藝為A3B3C2D1，而極差分析得出的最佳工藝是A3B3C1D1，所以需進(jìn)行驗證試驗.以上述2組最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗.結(jié)果表明，極差分析最優(yōu)工藝下花色苷含量為3.538 mg/g，RSD=1.28%(n=6)，正交試驗最優(yōu)工藝下花色苷平均含量為3.571 mg/g，RSD=0.78%(n=6).2種方法提取花色苷含量差距不大，從節(jié)約能耗，降低成本的角度考慮，選擇極差分析最優(yōu)工藝A3B3C1D1，即L-蘋果酸濃度為30%，料液比為1∶30，提取溫度為30 ℃，提取時間為60 min.

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.00.

3 討論

鑒于目前尚未見到L-蘋果酸提取黑豆花色苷的相關(guān)報道，本研究通過正交試驗法優(yōu)化了L-蘋果酸提取黑豆皮花色苷的工藝，研究了L-蘋果酸濃度、料液比、提取溫度和提取時間對黑豆皮花色苷得率的影響.結(jié)果表明，在最優(yōu)工藝提取下，黑豆皮花色苷含量為3.538 mg/g.一般來說工業(yè)化生產(chǎn)在10 g/mL左右，但該工藝條件下料液比較大，是由于干燥粉碎后的黑豆皮在吸水溶脹后沒有多余提取液，使花色苷溶解不完全，對花色苷含量有影響.因近年來合成色素的使用受到限制，黑豆作為一種新型天然的色素源也得到重視[19].同類花色苷提取溶劑多用無機(jī)酸或酸性醇溶液[21]，在后續(xù)處理中成本較高.L-蘋果酸作為一種安全、無毒、無害、可食用的功能性有機(jī)酸，可以通過減少老年機(jī)體組織內(nèi)自由基的產(chǎn)生或加速清除，起到防止自由基損傷機(jī)體組織的作用[20].L-蘋果酸雖價格上高于無機(jī)酸，但其本身是既是食品添加劑又是藥物工業(yè)原料，選擇作為溶劑提取的黑豆花色苷可直接作為安全可靠的食品原料和功能藥品中間體添加.試驗發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸提取黑豆皮花色苷可在室溫下進(jìn)行，溶劑充分的情況下，黑豆皮花色苷在L-蘋果酸溶液中溶解速度較快，提取時間短，提取率較高，節(jié)約能耗.L-蘋果酸本身具有抗氧化性，采用該溶劑提取的花色苷是否抗氧化性增強(qiáng)，還有待于進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

通過單因素和正交試驗分析，采用L-蘋果酸溶液提取黑豆皮花色苷的各個影響因素主次順序為料液比>L-蘋果酸濃度>提取時間>提取溫度，最優(yōu)工藝條件為：L-蘋果酸濃度30%、料液比1∶30，提取溫度30 ℃，提取時間為60 min.黑豆皮花色苷含量為3.538 mg/g.可為天然色素來源的花色苷的研究和開發(fā)提供參考依據(jù).