呂敏,李美玲,曹小路，王隴平，高文霞,張真，栗孟飛,

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅百草生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730000；3.榆中縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，甘肅 蘭州 730100)

桃兒七(SinopodophyllumhexandrumRoyle)為小檗科(Berberidaceae)桃兒七屬(Sinopodophyllum)多年生草本植物，主要分布于我國甘肅、青海、西藏等海拔2 000～4 000 m的區(qū)域[1].傳統(tǒng)藥理認(rèn)為其根莖具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、跌打損傷等功效[2].化學(xué)分析與現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，根莖中含有木脂素、酚、黃酮類等多種活性組分，其中木脂素類—鬼臼毒素(podophyllotoxin)含量最高(約12%)，其派生物替尼泊苷(teniposide)、依托泊苷(etoposide)和依托泊苷磷酸酯(etopophos)等具有顯著的抗癌、抗腫瘤、抗病毒等活性，并已廣泛應(yīng)用于臨床；另外，鬼臼毒素還具有治療性病尖銳濕疣、抗輻射、抗菌等生物學(xué)活性[3-5].由于其獨特與顯著的藥理學(xué)功能，促使人們對桃兒七資源過度采挖而使其面臨瀕危，已被列為國家二級保護(hù)植物，并被《中國紅皮書》收錄[6].

為了保護(hù)和利用桃兒七資源，很多學(xué)者就鬼臼毒素生物合成途徑解析及其調(diào)控[3,7]、桃兒七引種馴化栽培[8-9]、組織或細(xì)胞培養(yǎng)[10-11]等方面進(jìn)行了大量研究.為了提高組培或細(xì)胞培養(yǎng)的效率，很多學(xué)者對培養(yǎng)基類型、外源激素種類與濃度、活性炭濃度等進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基添加IAA(0.5 mg/L)、KT(0.2 mg/L)、GA3(0.3 mg/L)及0.1%活性炭較有利于無菌苗的誘導(dǎo)和地上部分生長，添加IBA(1.0 mg/L)較有利于生根[12-14].大量研究表明，培養(yǎng)環(huán)境對植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)具有顯著影響[15-17].前期研究發(fā)現(xiàn)，溫度或海拔高度對原生境或溫室栽培條件下桃兒七光合作用、生長(功能葉片形成與葉面積、鱗莖數(shù)增加、根伸長等)、鬼臼毒素生物合成及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用[18-20].到目前為止，對于溫度影響桃兒七組織或細(xì)胞培養(yǎng)的研究較少.因此，本研究以桃兒七成熟種胚為材料，探究不同溫度處理對無菌苗誘導(dǎo)及其生長特性的影響，旨在為桃兒七組織或細(xì)胞的快速繁殖提供技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 材料

以桃兒七成熟種子為材料，成熟果實于2017年8月采自甘肅省甘南藏族自治州卓尼縣納浪鄉(xiāng)，種子從果實中剝離、流水沖洗干凈、風(fēng)干后置于室溫備用.

1.2 方法

1.2.1 種子滅菌與接種 挑選飽滿的種子，用自來水沖洗表面粘液后，置于70%乙醇中消毒10 s，無菌水沖洗4～5次，再用0.1% HgCl2浸泡20 min，無菌水沖洗4～5次；然后用500 mg/L的GA3浸泡48 h.接種前再用上述滅菌方法對浸泡后的種子進(jìn)行2次滅菌，滅菌后將種子表面的多余水分用無菌濾紙吸干；在無菌條件下用解剖刀剝?nèi)〕墒旆N胚接種于MS+20.0 g/L 蔗糖+4.0 g/L瓊脂+0.5 mg/L IAA+0.2 mg/L KT+0.3 mg/L GA3+0.5 g/L活性炭的培養(yǎng)基上(pH5.8)，每瓶接種6個種胚.置于溫度22 ℃、光照(24 h，200 lx)的恒溫培養(yǎng)箱中.

1.2.2 種胚的溫度處理 將1.2.1中22 ℃條件下溫育15 d的種胚分別放置于15、22、30℃，光照(24 h，200 lx)恒溫光照培養(yǎng)箱中，每個處理30瓶(180株)，30 d后統(tǒng)計種胚成苗率及其生長特性(根長與株高).

1.2.3 無菌苗的溫度處理 將1.2.1中22 ℃條件下誘導(dǎo)60 d的無菌苗分別放置于15和22 ℃，光照(24 h，200 lx)恒溫光照培養(yǎng)箱中，每個處理30瓶(180株)，90 d后測定和統(tǒng)計無菌苗的株高、根長、莖和根直徑、抱窩鱗莖數(shù)、根數(shù)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及葉綠素含量[21]等生長指標(biāo).

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對種胚誘導(dǎo)成苗的影響

溫度對種胚誘導(dǎo)成苗具有顯著影響(表1和圖1)，低溫(15 ℃)條件下的成苗率(61.91%)分別為22 ℃和30 ℃的1.2和1.5倍；根長隨著溫度的降低呈逐漸增加，15 ℃根長(4.52 cm)分別為22 ℃和30 ℃的1.0和2.1倍；而株高受溫度的影響則相反.

表1 溫度對桃兒七種胚誘導(dǎo)的影響(n=30)

圖中A、B和C分別為種胚在15、22、30 ℃下生長30 d的狀況.Images A，B and C respectively represents embryo growth characteristics at 15，22 ，30 ℃ after 30 days.圖1 不同溫度桃兒七種胚生長情況 Figure 1 Growth conditions of seed embryo of Sinopodop-hyllum hexandrum at different temperatures

2.2 溫度對植株生長特性的影響

15 ℃相對22 ℃較有利于植株生長(圖2～3)，其中，15 ℃處理下地上部分高度(7.42 cm)和根莖長度(13.48 cm)均為22 ℃的1.1倍(圖2-A)；15 ℃莖(1.16 mm)和根(1.37 mm)的直徑分別為22 ℃的1.1和1.3倍(圖2-B)；15 ℃鱗莖(4個)和根(5條)分別為22 ℃的1.1和1.2倍(圖2-C)；15 ℃地上部分(0.35 g)和根莖(0.25 g)的鮮質(zhì)量分別為22 ℃的1.2和1.3倍(圖2-D)；15 ℃地上部分(0.068 g)和根莖(0.069 g)的干質(zhì)量分別為22 ℃的1.1和1.2倍(圖2-E)；15 ℃單株鮮質(zhì)量葉綠素a(0.39 mg/g)和葉綠素b(0.14 mg/g)含量均為22℃的1.3倍，15℃單株干質(zhì)量葉綠素a(0.60 mg/g)和葉綠素b(0.19 mg/g)含量分別為22 ℃的1.3和1.2倍(圖2-F).

3 討論與結(jié)論

溫度是影響植物生長的最重要環(huán)境因素之一，它影響植物整個生命周期的各個發(fā)育階段；植物的生長對溫度較敏感，溫度的變化會導(dǎo)致生長速率的明顯變化[22].在植物胚培養(yǎng)過程中，溫度顯著影響胚的生長發(fā)育；對大多數(shù)植株的胚培養(yǎng)，維持25 ℃左右的溫度較為適宜，而有些需要較低或較高的溫度，比如禾本科植物成熟胚的萌發(fā)溫度在15～18 ℃，馬鈴薯以20 ℃較好，有些植物的胚培養(yǎng)需要在變溫條件下進(jìn)行，比如桃胚的培養(yǎng)[23].在對桃兒七成熟胚培養(yǎng)過程中，漆燕玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在光照強(qiáng)度恒定的情況下，18～26 ℃變溫胚無菌苗的誘導(dǎo)率為48.33%，20、25 ℃的誘導(dǎo)率分別為41.67%和35.00%.本研究發(fā)現(xiàn)，低溫(15 ℃)條件下的胚誘導(dǎo)成苗率達(dá)到61.91%，分別為22、30 ℃的1.2和1.5倍，這說明較低的溫度有利于桃兒七成熟胚的離體培養(yǎng)與無菌苗的誘導(dǎo).

15和22 ℃處理90 d后地上部分和根莖的長度(A)、莖和根的直徑(B)、單株鱗莖和根的數(shù)量(C)、地上部分和根莖的鮮質(zhì)量(D)、地上部分和根莖的干質(zhì)量(E)和單株葉綠素含量(F).Images respectively represent the length of aerial parts and rhizome (A),diameter of stem and root (B),number of bulb and root (C),fresh weight of aerial parts and rhizome (D),dry weight of aerial parts and rhizome (E) as well as chlorophyll content on per plant basis (F) at 15 and 22 ℃ after 90 days.圖2 溫度對桃兒七植株生長的影響Figure 2 Effects of temperatures on seedling growth of Sinopodophyllum hexandrum

圖中A/C和B/D分別為15和22℃下代表性植株.Images A/C and B/D represent plants at 15，22 ℃,respectively.圖3 15、22 ℃處理90天后桃兒七植株生長特性Figure 3 Seedling growth characteristics of Sinopodop-hyllum hexandrum at 15，22 ℃ after 90 days

很多研究表明，桃兒七適宜于寒冷而濕潤生態(tài)環(huán)境，其藥材優(yōu)生的地形因子是海拔2 800～3 600 m區(qū)域[24].在海拔2 000～4 500 m范圍內(nèi)，其根莖主要活性組分—鬼臼毒素積累量與海拔高度呈顯著正相關(guān)[25-27].然而，海拔對桃兒七生長及活性組分的影響是溫度、光照和降雨量等氣候因子綜合作用的結(jié)果[1，24，28].前期通過高海拔原生境栽培發(fā)現(xiàn)，高海拔(3 300 m)有利于桃兒七植株的生長發(fā)育，主要表現(xiàn)在單株生物量、葉面積、鱗莖數(shù)和根數(shù)等優(yōu)于低海拔(2 300 m)植株[20]；通過對無菌苗進(jìn)行低溫處理后發(fā)現(xiàn)，適宜低溫(4～15 ℃)可通過提高光合效率、刺激鬼臼毒素生物合成中關(guān)鍵酶基因的高效表達(dá)，進(jìn)而顯著促進(jìn)(約5倍)鬼臼毒素的積累[19,29].另外，Kushwaha等[18]研究發(fā)現(xiàn)，低溫4～10 ℃有利于功能葉片的形成和根的伸長，以及促進(jìn)根系對營養(yǎng)元素的吸收，而較高溫度25 ℃易導(dǎo)致葉片衰老和根系活力的降低.本研究結(jié)果表明，低溫(15 ℃)相對于22 ℃較有利于無菌苗植株的生長發(fā)育，主要表現(xiàn)在地上部分高度、根莖長度、莖和根直徑、鱗莖和根數(shù)、地上部分和根莖鮮質(zhì)量與干質(zhì)量、葉綠素含量均不同程度增加.這可能與桃兒七自身長期適應(yīng)高海拔區(qū)域環(huán)境因素的遺傳特性直接相關(guān).該研究盡管只針對溫度影響桃兒七組織培養(yǎng)進(jìn)行了生長特性觀察與測定，但結(jié)果可為其組織或細(xì)胞培養(yǎng)條件提供重要的技術(shù)參考.