楊巧玲，金榮 ，崔丹丹，王玉萍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅省干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,甘肅省遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，是構(gòu)成核酸、磷脂、高能磷酸化合物等大分子物質(zhì)的重要組分[1]，并且在糖分代謝、能量傳遞、光合作用和信號(hào)傳導(dǎo)等方面起著重要的作用[2]，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有重要的影響.馬鈴薯是世界上第四大糧食作物，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在當(dāng)今人類(lèi)糧食結(jié)構(gòu)中占有重要的地位.磷被馬鈴薯吸收后，可以擴(kuò)大“源”的供應(yīng)能力和同化物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，有利于體內(nèi)的各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和代謝，增加塊莖干物質(zhì)和淀粉積累，提高塊莖的品質(zhì)和耐貯性[3].而缺磷，植株生長(zhǎng)緩慢，抑制碳水化合物向莖和根的運(yùn)輸，引起葉片中糖含量增加與花青素的積累[4]，不利于馬鈴薯植株生長(zhǎng)發(fā)育.

糖類(lèi)是植物組織生長(zhǎng)所需的能量物質(zhì)，也是植物體組織的重要構(gòu)成元件.糖作為重要的信號(hào)分子調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆境反應(yīng)等[5].植物對(duì)缺磷的最先反應(yīng)是地上部分的韌皮部蔗糖濃度增加，其根、莖、葉中積累大量的蔗糖、淀粉等糖類(lèi)[6].在低磷脅迫下，蔗糖可以促進(jìn)作物簇生根的密度增加[7]，根系的發(fā)育[8]，誘導(dǎo)花青素的合成與積累[9].近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖參與植物低磷脅迫的系統(tǒng)調(diào)節(jié)，韌皮部蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)在低磷條件下可能參與了根毛的產(chǎn)生、磷轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸酶分泌、根冠比改變和花青素合成的代謝途經(jīng).

近年來(lái)，關(guān)于作物耐低磷機(jī)理已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，前人研究主要集中在植株對(duì)磷的吸收效率及表觀性狀上[10-12]，而糖類(lèi)在植物調(diào)節(jié)低磷脅迫反應(yīng)中的作用機(jī)理還尚未明確.蔗糖在植物抗低磷脅迫反應(yīng)中有一定的作用，而其他二糖響應(yīng)低磷脅迫的研究較少.馬鈴薯耐低磷脅迫的研究起步較晚，二糖在應(yīng)答低磷脅迫反應(yīng)中的作用不明確.本研究選擇4種二糖作為糖源，在2個(gè)不同磷素水平下，探討馬鈴薯幼苗耐低磷脅迫的反應(yīng)機(jī)理.為揭示糖在植物響應(yīng)低磷脅迫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控作用奠定一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以馬鈴薯“大西洋”試管苗作為供試材料，由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 試驗(yàn)方法

馬鈴薯“大西洋”試管苗在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng).溫度(21±2)℃，光照時(shí)間h/d=16/8，光照強(qiáng)度150 μmol/(m2·s)培養(yǎng)15 d.待試管苗生根后，分別接種于0.1 mol/L的蔗糖(Sucrose，Suc)、海藻糖(Trehalose，Tre)、麥芽糖(Maltose，Mal)和乳糖(Lactose，Lac)為糖源不同濃度磷素的MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理7瓶，每瓶5株，設(shè)3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后，測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo).各種處理培養(yǎng)基的組成如表1所示.

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 根系形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 馬鈴薯試管苗用清水沖洗干凈，將根系剪下，用根系掃描分析儀進(jìn)行掃描，利用WinRHIZO軟件定量分析總根長(zhǎng)、根表面積、平均根直徑和側(cè)根數(shù).

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定 鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的測(cè)定采用恒質(zhì)量法[13].測(cè)量馬鈴薯試管苗莖葉和根系鮮質(zhì)量后將其立即放入恒溫干燥箱內(nèi)80 ℃烘90 min，于65 ℃烘至恒質(zhì)量，分別測(cè)定其干質(zhì)量，計(jì)算根冠比，根冠比=根系干質(zhì)量/地上部分干質(zhì)量.

1.3.3 無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定 稱取0.5 g葉片，加入1 mL 10%高氯酸低溫研磨至勻漿，加入9 mL 5%高氯酸，冰浴30 min，4 ℃下10 000×g離心10 min，取上清為待測(cè)液.采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量[11].量取2 mL測(cè)定液(10%抗壞血酸溶液和40%鉬酸銨溶液，其體積比為1∶6)，加入1 mL待測(cè)液，42 ℃水浴保溫20 min流水冷卻，在波長(zhǎng)為820 nm測(cè)定其吸光值，計(jì)算樣品中無(wú)機(jī)磷含量.

表1 各處理培養(yǎng)基的組成

1.3.4 花青素含量的測(cè)定 花青素的提取采用有機(jī)溶劑浸提[14].取0.5 g葉片，加入6 mL提取液(鹽酸和甲醇，其體積比為1∶99)研磨成勻漿，4 ℃、7 000×g、離心10 min，取上清液備用.分別在波長(zhǎng)為530 nm和657 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算花青素的含量.

1.3.5 淀粉含量的測(cè)定 淀粉含量的測(cè)定采用碘比色法[15].準(zhǔn)確稱量1 g葉片，加入2 mL蒸餾水研磨成勻漿，加入3.2 mL 60%高氯酸攪拌混勻，離心管中反應(yīng)10 min后，定容至10 mL，顛倒混勻，25 ℃、5 000×g，離心10 min.取1 mL上清液、3 mL蒸餾水、2 mL碘試劑于試管中，混勻靜置5 min，定容至10 mL，在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算淀粉含量.

1.3.6 蔗糖含量測(cè)定 參照Ohara-Takada等[17]方法測(cè)定蔗糖含量.稱取2 g葉片，溶于20 mL 80%乙醇中，80 ℃水浴提取60 min，25 ℃、10 000×g，離心20 min.取上清液真空干燥并溶解于5 mL蒸餾水中，經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾后，濾液中蔗糖含量用高效液相色譜儀(Agilent 1100 series，UV 檢測(cè)器，Amide-80 色譜柱)測(cè)定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雙糖在兩個(gè)磷素水平對(duì)馬鈴薯幼苗的根系形態(tài)影響

正常供磷條件下根系形態(tài)的定量分析如表2所示，馬鈴薯幼苗的總根長(zhǎng)、根表面積和側(cè)根數(shù)在4種雙糖處理下與對(duì)照相比均有顯著變化，平均根直徑無(wú)顯著變化.在蔗糖處理下，馬鈴薯幼苗的總根長(zhǎng)為94.53 cm，根表面積11.46 cm2，側(cè)根數(shù)為41.65，均為最大值.低磷條件下根系形態(tài)的定量分析如表3所示，馬鈴薯幼苗的總根長(zhǎng)、根表面積、平均根直徑和側(cè)根數(shù)在4種雙糖處理下與對(duì)照相比均有顯著變化，在蔗糖處理下，馬鈴薯幼苗的總根長(zhǎng)為69.24 cm，根表面積9.72 cm2，側(cè)根數(shù)為27.64，均為最大值.以上結(jié)果表明，4種雙糖在兩個(gè)磷素水平下促進(jìn)馬鈴薯幼苗總根長(zhǎng)、根表面積和側(cè)根數(shù)的增加，低磷條件下能促進(jìn)平均根直徑增加.不同二糖糖源在兩個(gè)磷素水平下馬鈴薯幼苗的形態(tài)如圖2～3所示，在低磷條件下馬鈴薯試管苗矮小，添加糖源其形態(tài)優(yōu)于對(duì)照，說(shuō)明磷素和4種雙糖影響馬鈴薯植株的生長(zhǎng)發(fā)育.

表2 不同糖源在正常供磷下對(duì)馬鈴薯幼苗根系形態(tài)的影響

不同字母表示處理間在P<0.05時(shí)存在顯著差異.

Different letters mean significant difference atP<0.05 between treatments.The same as below.

表3 不同糖源在低磷條件下對(duì)馬鈴薯幼苗根系形態(tài)的影響

圖1 不同糖源在正常供磷下對(duì)馬鈴薯幼苗形態(tài)的影響Figure 1 The effect of different sugar with normal Pi on morphology of potato seedling

2.2 4種雙糖在2個(gè)磷素水平對(duì)馬鈴薯幼苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和根冠比的影響

明確不同糖源在2個(gè)磷素水平下對(duì)馬鈴薯幼苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和根冠比的影響.結(jié)果如表2和表3所示，磷濃度為1.25 mmol/L時(shí)，馬鈴薯試管苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和根冠比在蔗糖處理下最大，分別是對(duì)照的2.60倍、3.72倍和1.89倍.磷濃度為0.5 mmol/L時(shí)，馬鈴薯試管苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和根冠比也在蔗糖處理下最大，分別是對(duì)照的3.16倍、6.57倍和1.77倍.這表明4種雙糖在2種磷素水平下能促進(jìn)馬鈴薯植株的生長(zhǎng)發(fā)育和干物質(zhì)的積累，其中蔗糖的促進(jìn)效果最佳，在低磷條件下促進(jìn)效果更明顯.

圖2 不同糖源在低磷條件下對(duì)馬鈴薯幼苗形態(tài)的影響Figure 2 The effect of different sugar with deficiency Pi on morphology of potato seedling

表4 不同糖源在正常供磷下馬鈴薯幼苗的根冠比

表5 不同糖源在低磷脅迫下馬鈴薯的根冠比

2.3 4種雙糖在2個(gè)磷素水平對(duì)馬鈴薯幼苗的磷含量的影響

正常供磷下幼苗磷含量的結(jié)果如圖3所示，以蔗糖、海藻糖和乳糖為糖源與對(duì)照相比其莖葉磷含量分別降低了25.3%、26.0%和48.7%，而麥芽糖與對(duì)照相比無(wú)顯著差異.以蔗糖、海藻糖、麥芽糖和乳糖為糖源時(shí)根系磷含量分別是對(duì)照組的4.67、2.29、6.01和5.41倍.這表明在正常供磷的條件下麥芽糖對(duì)馬鈴薯地上部分磷轉(zhuǎn)運(yùn)幾乎沒(méi)有作用，其他3種糖源均促進(jìn)磷轉(zhuǎn)運(yùn)使其含量降低.低磷脅迫下幼苗磷含量的結(jié)果如圖4所示，以蔗糖、海藻糖和麥芽糖為糖源與對(duì)照相比其莖葉磷含量分別降低了25.0%、26.6%和59.5%.以蔗糖、海藻糖、麥芽糖和乳糖為糖源時(shí)根系磷含量分別是對(duì)照的1.64、4.94、2.74和4.37倍.這表明低磷條件下乳糖對(duì)馬鈴薯地上部分磷轉(zhuǎn)運(yùn)幾乎沒(méi)有作用，其他3種糖源均促進(jìn)磷轉(zhuǎn)運(yùn)使其含量下降.以上結(jié)果表明在2種磷素水平下，4種糖源均可調(diào)節(jié)根系磷轉(zhuǎn)運(yùn).

圖3 四種雙糖正常磷素下幼苗磷含量Figure 3 The Pi content in seedling under different sugar source with normal Pi.

2.4 4種雙糖在兩個(gè)磷素水平對(duì)馬鈴薯葉片中蔗糖、花青素和淀粉積累的影響

結(jié)果如圖5所示，對(duì)不同糖源在2個(gè)磷素水平下葉片中的蔗糖、花青素和淀粉含量進(jìn)行聚類(lèi)分析，由上到下聚為3大類(lèi)，第一大類(lèi)，對(duì)淀粉積累的影響不顯著；無(wú)糖源供給時(shí)，低磷條件蔗糖含量下降，有利于花青素的積累；磷濃度為0.5 mmol/L，麥芽糖促進(jìn)蔗糖含量的增加，對(duì)花青素的積累無(wú)影響；第二大類(lèi)，磷濃度為0.5 mmol/L，乳糖能促進(jìn)淀粉、蔗糖和花青素的積累，其中花青素的含量是對(duì)照的3.68倍；磷濃度為1.25 mmol/L，乳糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)淀粉的積累影響較小，對(duì)蔗糖的促進(jìn)作用不明顯，可以促進(jìn)花青素的積累；第三大類(lèi)，磷濃度為0.5 mmol/L，蔗糖和海藻糖可以促進(jìn)花青素和蔗糖含量的增加；磷濃度為1.25 mmol/L，海藻糖能促進(jìn)花青素和蔗糖的積累.

圖4 四種雙糖低磷脅迫下幼苗磷含量Figure 4 The Pi content in seedling under different sugar source with deficiency Pi.

圖5 不同糖源不同磷素水平馬鈴薯葉片中蔗糖、花青素和淀粉含量的聚類(lèi)分析Figure 5 Clustering analysis of different sugar source with different levels of Pi concentration on sucrose,anthocyanin and Starch content of potato seedling

3 討論

植物在低磷脅迫下根系形態(tài)發(fā)生變化如根的長(zhǎng)度和直徑、根毛和側(cè)根的數(shù)量等來(lái)擴(kuò)大根系與環(huán)境中磷的接觸面積，提高植物對(duì)磷的吸收效率[18].在低磷條件下，植物地下部分生物量及根冠比明顯增加[19].有研究發(fā)現(xiàn)，在低磷條件下，蔗糖會(huì)影響植物側(cè)根和根毛的發(fā)育，促進(jìn)根毛的增長(zhǎng)，使根毛數(shù)量增加[20].而在本研究中海藻糖、麥芽糖和乳糖也會(huì)影響根形態(tài)，表明雙糖通過(guò)促進(jìn)根系生物量和磷含量、根冠比的增加，促進(jìn)根形態(tài)變化，來(lái)緩解低磷脅迫對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的影響.與其他糖源相比，蔗糖作用效果最好，更有利于植物根系的建成.

低磷條件下，光合作用下降，糖水平增加，葉片中淀粉、蔗糖和花青素含量增加，植物磷含量降低[21-23].有研究表明，在低磷脅迫時(shí)，植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成下降，蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，促進(jìn)了花青素的合成與積累，葉子會(huì)呈現(xiàn)不正常的暗綠色或紫紅色[22].本研究發(fā)現(xiàn)，在低磷脅迫下，乳糖不能促進(jìn)磷在莖葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)，但能促進(jìn)花青素在葉片中的積累，且促進(jìn)效果最好，麥芽糖對(duì)花青素的積累無(wú)影響，4種糖源均可促進(jìn)蔗糖和淀粉的積累.可能是不同的糖源對(duì)磷轉(zhuǎn)運(yùn)和花青素積累的作用不同，糖的轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)促進(jìn)花青素的積累.這說(shuō)明植株生長(zhǎng)特性和碳水化合物積累能力與植株對(duì)磷素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)弱以及糖源有緊密的聯(lián)系.

植物為了適應(yīng)低磷脅迫，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中已獲得一些應(yīng)對(duì)策略，主要包括調(diào)整根形態(tài)結(jié)構(gòu)、重新分配體內(nèi)磷素、積累花青素以及調(diào)節(jié)糖代謝等方式，以期保護(hù)自身免受低磷傷害[24].本試驗(yàn)雙糖對(duì)馬鈴薯低磷脅迫的生理調(diào)控(圖6)，以蔗糖、海藻糖、麥芽糖和乳糖為糖源，均可促進(jìn)馬鈴薯幼苗生物量增加、根系磷的吸收、葉片蔗糖和淀粉的積累.乳糖不能促進(jìn)莖葉磷轉(zhuǎn)運(yùn)，麥芽糖對(duì)花青素的合成與積累無(wú)影響.雖然不同雙糖調(diào)節(jié)方式有所不同，但可以提高馬鈴薯幼苗對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)性.

圖6 低磷脅迫對(duì)馬鈴薯的生理作用Figure 6 Physiological effects of low phosphorus stress on potato