趙偉進(jìn)，張格杰，王孝先，劉曉鳳，盧玉君，何建清

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院；西藏 林芝 860000)

青稞，即裸大麥(Hordeumvulgare)，是藏族人民的主糧，其中黑青稞含有多種有益人體健康的礦物質(zhì)元素及含有獨(dú)特的花青素類物質(zhì)，是西藏重要的特色資源并倍受關(guān)注，同時(shí)黑青稞生產(chǎn)對(duì)維護(hù)西藏地區(qū)糧食安全、社會(huì)穩(wěn)定和積極推動(dòng)西藏地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有積極作用[1].劉國(guó)一等[2]研究表明氮素是西藏一江兩河地區(qū)青稞生長(zhǎng)及產(chǎn)量的限制因子[2]；但是過(guò)量施用氮肥所帶來(lái)的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題也日趨顯著[3]，而現(xiàn)在相關(guān)研究表明利用固氮細(xì)菌在禾本科作物根部的固氮作用，在一定程度上可減少化學(xué)肥料的使用[4-5].聯(lián)合固氮細(xì)菌是具有固氮能力的一類植物根際促生菌，近年來(lái)，植物根際聯(lián)合固氮研究受到了極大關(guān)注，且研究表明，在小麥、燕麥、玉米、青稞等禾本科植物根際均存在著聯(lián)合固氮作用，并在田間試驗(yàn)取得較好的成果[4-6].隨著人們對(duì)微生物肥料的促生作用和無(wú)公害農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的日益重視，聯(lián)合固氮菌肥越來(lái)越受到人們的青睞[7].本研究旨在利用制作聯(lián)合固氮菌肥，測(cè)定其對(duì)黑青稞生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響，為聯(lián)合固氮菌肥在西藏地區(qū)應(yīng)用和推廣提供理論和實(shí)踐依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在西藏農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行.試驗(yàn)點(diǎn)平均海拔2 990 m，年平均氣溫8.8 ℃，年降水量650～700 mm，年日照2 022 h，無(wú)霜期180 d，土壤為砂壤土[8].試驗(yàn)有機(jī)質(zhì)含量為19.10 g/kg、全磷含量為2.3 g/kg、有效磷4.02 mg/kg、堿解氮132.5 mg/kg、土壤pH為5.85.

1.2 菌株和菌肥制作

試驗(yàn)用菌株是從西藏山南隆孜縣黑青稞根際篩選的優(yōu)良的功能菌株，固氮菌菌株HQ3-3、HQ3-5和HQ7-4有效的氮含量分別為116.02、120.82、112.20 mg/L.將篩選的固氮菌株分別接種在LB培養(yǎng)基中，置于28 ℃，160 r/min培養(yǎng)7 d后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各菌株發(fā)酵液D值.當(dāng)D660值大于0.5即發(fā)酵菌液中的細(xì)胞數(shù)目≥10×108個(gè)/mL時(shí)，用滅菌水將各發(fā)酵菌液調(diào)至相同的光密度值(OD660=0.7)，備用[9].

菌肥載體：將腐質(zhì)土干燥、粉碎，過(guò)篩(0.15 mm)，按照腐殖土與珍珠巖1∶1混合，調(diào)pH值至7.0將其在121 ℃下間歇滅菌3 h后分裝成500 g小袋.

在菌肥載體上分別接種上述制作的固氮菌株發(fā)酵液150 mL，將菌液與菌肥載體充分混勻后置于30 ℃培養(yǎng)14 d后常溫保存[9].

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固氮菌肥肥效試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：對(duì)照(CK)，菌肥載體(腐殖土與珍珠巖1∶1)處理(CK1)，全量氮肥(CN)，固氮菌肥(BN)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見(jiàn)如表1.播種前以磷肥(過(guò)磷酸鈣)及尿素(150 kg/hm2)作基肥施入.供試青稞為西藏山南隆孜縣六棱黑青稞，種子發(fā)芽率為85%.試驗(yàn)前用上述制作的菌肥拌黑青稞種子4～5 h后播種，菌肥用量按照與種子重量的1∶1進(jìn)行條播，行距25 cm.小區(qū)面積2.5 m×1.2 m，埂寬30 cm，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)[10].

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

菌肥質(zhì)量檢測(cè)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法和觀察法[11]，于青稞不同生育時(shí)期(苗期、抽穗期、灌漿期、成熟期)測(cè)定植株自然高度，每小區(qū)隨機(jī)取10株，求平均值；拔節(jié)期、抽穗期在每小區(qū)隨機(jī)取10株，用排水法測(cè)量根體積；主根長(zhǎng)度采用每樣地隨機(jī)取10株求平均值的方法；成熟時(shí)各小區(qū)單獨(dú)收獲，測(cè)定各小區(qū)籽粒產(chǎn)量[9].

用半微量凱氏定氮法測(cè)定拔節(jié)期、抽穗期地上部粗蛋白含量及籽粒粗蛋白含量[12]，采用鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷含量[13]，采用聚酯纖維濾網(wǎng)袋法測(cè)定青稞秸稈纖維素含量[14]，火焰原子吸收法測(cè)定青稞秸稈及青稞籽粒K及Zn含量[15]，用殘余法測(cè)定青稞籽粒粗脂肪的含量[16].

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 2016軟件處理，SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析，Origin 2018軟件作圖.

表1 各處理化肥用量及菌肥施用方案

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌肥檢測(cè)

將本研究制作的3種固氮菌肥BN-1、BN-2及BN-3于室溫下儲(chǔ)存，菌肥經(jīng)30、60、120 d制作的3種聯(lián)合固氮菌肥其有效固氮菌數(shù)量均在5.00×108個(gè)/g以上，但180 d時(shí)3種聯(lián)合固氮菌肥其有效固氮菌數(shù)量為低于5.00×108個(gè)/g，如表2所示，無(wú)雜菌污染.

表2 固氮菌肥的質(zhì)量檢查結(jié)果

“+”表示污染；“-”表示無(wú)污染.

‘+’means contaminated；‘-’means uncontaminated.

2.2 固氮菌肥對(duì)青稞株高的影響

如圖1所示，在苗期，固氮菌肥BN-3處理下的青稞株高與氮肥(CN)處理無(wú)顯著差異，與基質(zhì)對(duì)照(CK1)、空白對(duì)照(CK)差異顯著(P<0.05)，促進(jìn)作用明顯，與空白對(duì)照(CK)相比增加14.23%.在拔節(jié)期，BN-2和BN-3菌肥處理的株高與基質(zhì)對(duì)照(CK1)、空白對(duì)照(CK)差異顯著(P<0.05)，與空白對(duì)照(CK)相比分別增加了44.59%、39.72%.在抽穗期，BN-2菌肥處理的株高與基質(zhì)對(duì)照(CK1)、空白對(duì)照(CK)差異顯著(P<0.05)，與空白對(duì)照(CK)相比增加了4.88%.在成熟期，BN-2和BN-3菌肥處理的株高與基質(zhì)對(duì)照(CK1)、空白對(duì)照(CK)差異顯著(P<0.05)，與空白對(duì)照(CK)相比分別增加了18.02%、7.98%.在拔節(jié)、抽穗及成熟期氮肥(CN)處理與3種菌肥處理差異顯著(P<0.05)，與基質(zhì)對(duì)照(CK1)、空白對(duì)照(CK)亦有顯著差異(P<0.05)，與空白對(duì)照(CK)相比分別增加49.50%、10.39%、21.94%.菌肥BN-2處理下拔節(jié)、抽穗及成熟期的株高效果接近全氮(CN)處理.

不同小字母表示處理間差異顯著(P<0.05).Different lowercase letters indicate significant differences in different (P<0.05).圖1 不同施肥處理對(duì)青稞株高的影響Figure 1 Effects of the fertilization on plant height of black highland barley

綜上所述，固氮菌肥對(duì)株高的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)在苗期，在拔節(jié)、抽穗及成熟期菌肥對(duì)株高促進(jìn)效果增幅較小，整體效果不及氮肥(CN)的處理.

2.3 固氮菌肥對(duì)青稞主根長(zhǎng)度及根體積影響

從主根長(zhǎng)度看(表3)，固氮菌肥處理(BN-1、BN-2和BN-3)在生育期拔節(jié)期和抽穗期內(nèi)雖表現(xiàn)出了一定的促進(jìn)效果，與氮肥(CN)、基質(zhì)對(duì)照(CK1)和空白對(duì)照(CK)差異顯著(P<0.05)，拔節(jié)期與抽穗期固氮菌肥處理與CK相比增加幅度分別為14.26%～17.50%、12.46%～19.47%.

從根體積來(lái)看(表3)，拔節(jié)期和抽穗期菌肥BN-1和BN-3表現(xiàn)出較好的促生效果，與氮肥(CN)無(wú)顯著性差異，與基質(zhì)對(duì)照(CK1)和空白對(duì)照(CK)相比有顯著差異(P<0.05).

2.4 固氮菌肥對(duì)青稞秸稈的影響

2.4.1 固氮菌肥對(duì)青稞秸稈粗蛋白、P及K含量的影響 由表4可知，拔節(jié)期BN-2、BN-3及CN處理下的黑青稞秸稈粗蛋白含量分別比對(duì)照(CK)增加21.89%、28.93%、14.29%，差異顯著(P<0.05).抽穗期固氮菌肥及CN施肥處理下粗蛋白含量均低于空白對(duì)照(CK)，其中菌肥BN-1、BN-2和BN-3與CN處理差異顯著(P<0.05).拔節(jié)期菌肥BN-2處理下的鉀含量與空白(CK)相對(duì)比無(wú)顯著差異(P<0.05)，其他施肥處理下鉀含量均比對(duì)照(CK)低；抽穗期各施肥處理鉀含量均低于對(duì)照(CK)，且差異顯著(P<0.05).拔節(jié)期菌肥BN-2及BN-3處理下，磷含量均高于對(duì)照(CK)且差異顯著；抽穗期各施肥處理磷含量均低于對(duì)照(CK)且差異顯著(P<0.05).菌肥BN-2處理下拔節(jié)期和抽穗期的青稞秸稈促進(jìn)K、P和N的吸收.

表3 不同施肥處理對(duì)青稞主根長(zhǎng)度及根體積的影響

同列不同小字母表示差異顯著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

表4 不同施肥處理對(duì)黑青稞秸稈粗蛋白、P及K含量的影響

同列不同小字母表示差異顯著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

2.4.2 固氮菌肥對(duì)青稞秸稈纖維素的影響 由圖2可知拔節(jié)期與抽穗期黑青稞的中性洗滌纖維(NDF)含量顯著高于酸性洗滌纖維 (ADF).拔節(jié)期各施肥處理下中性洗滌纖維(NDF)含量均顯著低于對(duì)照(CK)(P<0.05)；但固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)處理下中性洗滌纖維(NDF)含量均顯著高于CN處理(P<0.05).抽穗期固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)及CN處理下的中性洗滌纖維(NDF)含量均低于對(duì)照(CK)差異顯著，但固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)處理下中性洗滌纖維(NDF)含量均高于CN處理，差異顯著(P<0.05).

黑青稞秸稈酸性洗滌纖維(ADF)含量(圖2)拔節(jié)期CN處理下的含量最高，同時(shí)固氮菌肥BN-1、BN-2及BN-3含量均低于對(duì)照(CK)差異顯著.抽穗期BN-1、BN-2和BN-3處理下酸性洗滌纖維(ADF)含量均高于對(duì)照(CK)，相對(duì)于對(duì)照(CK)含量分別增加7.62%、1.94%、6.58%，差異顯著(P<0.05).

圖2 不同施肥處理對(duì)黑青稞秸稈纖維素的影響Figure 2 Effects of the fertilization on neutral detergent fibre,acid detergent fibre and hemicellulose of black highland barley

在拔節(jié)期及抽穗期固氮菌肥及CN處理下黑青稞秸稈半纖維素含量均低于對(duì)照(CK)，差異顯著(P<0.05)，但拔節(jié)期固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)處理下半纖維素含量均高于CN處理，顯著差異；抽穗期BN-1、BN-2處理下半纖維素含量與CN處理無(wú)顯著差異.固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)處理下拔節(jié)期到抽穗期中性洗滌纖維 (NDF)含量呈遞減趨勢(shì)，酸性洗滌纖維 (ADF)呈遞增趨勢(shì).

2.5 固氮菌肥對(duì)青稞籽粒的影響

2.5.1 固氮菌肥對(duì)青稞籽粒粗蛋白、粗脂肪、P、K及Zn含量的影響 由表5可知，3種菌肥中菌肥BN-2促進(jìn)K、P、Zn的在青稞籽粒中的積累，菌肥BN-3促進(jìn)氮元素的積累，菌肥BN-1促進(jìn)粗脂肪的積累.固氮菌肥BN-1、BN-2和BN-3處理下的黑青稞籽粒粗蛋白含量均低于對(duì)照(CK)，差異顯著(P<0.05).CN施肥處理下粗蛋白含量最高，比空白對(duì)照(CK)含量增加31.63%，差異顯著(P<0.05).從鉀含量百分比中看(表5)，菌肥BN-2及CN處理下籽粒的鉀百分含量與空白(CK)相對(duì)比差異顯著(P<0.05)，相比對(duì)照(CK)分別增加6.67%、4.76%.表6表明，菌肥BN-2及CN處理下，籽粒磷含量均高于對(duì)照(CK)，差異顯著，相比對(duì)照(CK)分別增加10.48%、7.73%.固氮菌肥BN-1、BN-2和BN-3處理下的籽粒鋅含量高于對(duì)照(CK)，與對(duì)照(CK)相比分別增加了20.27%、53.65%、2.89%.籽粒粗脂肪含量(表5)除菌肥BN-1處理，其他施肥處理下的粗脂肪含量均低于對(duì)照(CK)，差異顯著.菌肥BN-1處理的籽粒粗脂肪含量比對(duì)照(CK)增加16.26%.

表5 不同施肥處理對(duì)黑青稞籽粒粗蛋白、粗脂肪、P、K及Zn含量的影響

同列不同小字母表示差異顯著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate differences significant ficant(P<0.05).

2.5.2 固氮菌肥對(duì)青稞籽粒產(chǎn)量的影響 從籽粒千粒重上看(表6)，固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)處理與氮肥(CN)處理無(wú)顯著差異(P>0.05)，與基質(zhì)對(duì)照(CK1)和空白對(duì)照(CK)相比均有顯著增加(P<0.05).從籽粒產(chǎn)量上看(表6)，各施肥處理比對(duì)照均有顯著增加，籽粒產(chǎn)量CN>BN-3>BN-2>BN-3>CK1>CK，其中以CN的產(chǎn)量最高；而3種菌肥中以BN-3的產(chǎn)量為最高.

表6 不同施肥處理對(duì)黑青稞籽粒產(chǎn)量的影響

同列不同小字母表示差異顯著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

3 討論

本研究的施用菌肥BN-3與空白對(duì)照(CK)相比在拔節(jié)、抽穗及成熟期黑青稞的株高分別增加了44.59%、4.88%、18.02%；CN處理下與空白對(duì)照(CK)相比分別增加49.50%、10.39%、21.94%.拔節(jié)、抽穗及成熟期菌肥BN-3處理下的黑青稞株高接近全氮(CN)處理.菌肥BN-1處理下促進(jìn)黑青稞地下部分生長(zhǎng).這張堃等[7]、席琳喬等[17]分別利用聯(lián)合固氮菌株制作的接種劑接種于青稞、燕麥，對(duì)其株高、生物量及粗蛋白等都有不同程度的促進(jìn)結(jié)果相一致.

固氮菌肥及CN施肥處理下的黑青稞秸稈的NDF、ADF及半纖維素含量均低于對(duì)照(CK)含量.固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)處理下拔節(jié)期到抽穗期中性洗滌纖維 (NDF)含量呈遞減趨勢(shì)，酸性洗滌纖維 (ADF)呈遞增趨勢(shì).中性洗滌纖維 (NDF)含量顯著高于酸性洗滌纖維 (ADF).這與王凱等[18]、宋萍等[19]對(duì)青稞秸稈中粗纖維含量測(cè)定的所得結(jié)論相一致.

本研究CN、BN-2、BN-3施肥處理下的黑青稞籽粒千粒重、籽粒產(chǎn)量均顯著高于對(duì)照(CK)，但固氮菌肥BN-2和BN-3處理下的籽粒產(chǎn)量不及CN處理.張堃等研究的固氮菌肥接種在青稞上，在一定生育期內(nèi)，半量氮肥+固氮菌肥處理表現(xiàn)的促生效果及產(chǎn)量與全量氮肥相近的結(jié)論相一致[20].

閻世江等[21]、于健等[22]研究表明不同的菌肥與化肥的施肥方式其作物其產(chǎn)量效果不同，外界因素如土壤類型、菌肥類型，施用方式等都可影響聯(lián)合固氮菌肥的施用效果[23-24].本研究探究了單一菌株的菌肥施用效果，因此，聯(lián)合固氮菌株的菌肥肥效試驗(yàn)還需要進(jìn)一步的深入研究.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以LB培養(yǎng)基和腐殖土與珍珠巖為載體制作的固體菌肥經(jīng)180 d，檢測(cè)有效固氮菌數(shù)量均在2.00×108個(gè)/g以上，且無(wú)雜菌污染，符合《農(nóng)用微生物菌劑》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

本試驗(yàn)制作的3種聯(lián)合固氮菌肥可促進(jìn)黑青稞的生長(zhǎng)，對(duì)黑青稞主根長(zhǎng)度、根體積、粗蛋白含量、籽粒產(chǎn)量，均與對(duì)照(CK)相比有促進(jìn)作用；其中菌肥BN-3在制作的3種菌肥的效果最好，促進(jìn)黑青稞地上部分生長(zhǎng)，促進(jìn)K、P、N的在青稞秸稈和籽粒中的積累，產(chǎn)量達(dá)到了3 328.2 kg/hm2，處理效果整體次于CN處理，說(shuō)明研制的菌肥BN-3在一定程度上可部分替代氮肥.因此，菌肥BN-3可根據(jù)實(shí)際情況與化肥適量配合施用.