左煜昕，馬靖福，劉媛，張沛沛，栗孟飛，程宏波，陳思瑾，楊德龍

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上僅次于水稻的主糧作物，為人類提供20%的熱量和蛋白質(zhì)，其產(chǎn)量高低直接關(guān)系到世界糧食安全[1-2].在我國(guó)，小麥作為四大主糧作物之一，根據(jù)小麥的生產(chǎn)特性及地理環(huán)境，小麥的生產(chǎn)區(qū)域可以劃分為北方冬麥區(qū)、南方冬小麥區(qū)和春麥區(qū)，并且北方冬麥區(qū)為全國(guó)小麥的主要生產(chǎn)區(qū)域，其產(chǎn)量超過(guò)全國(guó)小麥產(chǎn)量的60%[3].隨著全球氣候變暖，旱災(zāi)頻發(fā)，導(dǎo)致該區(qū)域小麥減產(chǎn)嚴(yán)重[1,4-5].因此，深入研究不同地理區(qū)域的冬小麥抗旱基因的遺傳多樣性，挖掘優(yōu)異抗旱種質(zhì)資源，對(duì)冬小麥抗旱遺傳改良具有重要意義.

小麥遺傳資源多樣性的研究為小麥新品種的選育提供了理論指導(dǎo)[6].吳秀婷等[7]利用分蘗、株高、葉片數(shù)、單株總?cè)~面積、抽穗時(shí)間、灌漿時(shí)間和籽粒產(chǎn)量等形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)小麥遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，育種親本的單一導(dǎo)致育成品種的遺傳多樣性下降，增加了今后新品種育成的難度.近年來(lái)，隨著小麥基因組測(cè)序的深入，分子標(biāo)記得到迅速發(fā)展，尤其是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記由于其具有數(shù)量多、分布廣、高度穩(wěn)定、適于高通量檢測(cè)、易于基因分型等特點(diǎn)[8-9]，被廣泛應(yīng)用地應(yīng)用于作物遺傳多樣性研究[10].Akhunov等[9]報(bào)道了Illumina技術(shù)平臺(tái)開(kāi)發(fā)的90K SNP芯片技術(shù)，并將其成功應(yīng)用于四倍體小麥[9]和六倍體小麥[12-13]的多態(tài)性檢測(cè).Ren 等[14]利用覆蓋小麥全基因組的946個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)150份硬粒小麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在該材料群體中小麥品種的遺傳多樣性呈地方品種到早期選育種逐漸降低的趨勢(shì)，并且硬粒小麥品種的遺傳多樣性隨著生態(tài)區(qū)域的變化而變化，以歐洲和美洲的品種遺傳多樣性最高；曹廷杰等[15]采用高密度SNP標(biāo)記90K芯片對(duì)河南省近幾年審定小麥品種的遺傳基礎(chǔ)分析發(fā)現(xiàn)，在小麥A、B和D 3個(gè)基因組上SNP標(biāo)記的密度不同，呈現(xiàn)出B>A>D的分布趨勢(shì)，并發(fā)現(xiàn)在小麥的4D染色體上分布的多態(tài)性標(biāo)記最少，檢測(cè)的種質(zhì)材料間遺傳相似度較高，種質(zhì)遺傳多樣性逐漸降低，需要引入新的種質(zhì)資源來(lái)拓寬小麥種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ).此外，SNP標(biāo)記在小麥遺傳圖譜構(gòu)建、基因精細(xì)定位、農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析、分子標(biāo)記輔助育種等方面發(fā)揮著重要作用[7].本研究利用35K基因芯片對(duì)不同來(lái)源的124份小麥抗旱種質(zhì)材料進(jìn)行基因分型，解析其遺傳多樣性背景和親緣關(guān)系，為旱地冬小麥育種親本選配提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

以前期篩選的來(lái)源于不同生態(tài)區(qū)的124份優(yōu)異抗旱品種為試驗(yàn)材料(表1).這些材料在多年的田間表型鑒定中，其產(chǎn)量性狀和與抗旱相關(guān)的生理性狀表現(xiàn)出顯著的差異[16-17].

表1 供試小麥材料信息

47豫麥18Yumai18河南Henan109輪選987Lunxuan987北京Beijing481R8美國(guó)America110石4185Shi4185河北Hebei491R14美國(guó)America111石家莊8號(hào)Shijiazhuang8河北Hebei501R20美國(guó)America112石麥12號(hào)Shimai12河北Hebei511R19美國(guó)America113石麥13號(hào)Shimai13河北Hebei52寧麥5號(hào)Ningmai5甘肅Gansu114四棱紅葫蘆頭Silenghonghulutou河北Hebei531R6美國(guó)America115西峰16Xifeng16甘肅Gansu541R5美國(guó)America116西峰20Xifeng20甘肅Gansu551R1美國(guó)America117西農(nóng)688Xinong688陜西Shanxi續(xù)表1 Continuedtable1編號(hào)No.材料Accession產(chǎn)地Origin編號(hào)No.材料Accession產(chǎn)地Origin56隴鑒127Longjian127甘肅Gansu118西農(nóng)797Xinong797陜西Shanxi57隴鑒3號(hào)Longjian3甘肅Gansu119西農(nóng)979Xinong979陜西Shanxi58隴麥844Longmai844甘肅Gansu120運(yùn)旱21-30Yunhan21-30山西Shanxi591R39美國(guó)America121隴原937Longyuan937甘肅Gansu601R38美國(guó)America122運(yùn)旱23-35Yunhan23-35山西Shanxi6111R27美國(guó)America123蘭天13Lantian13甘肅Gansu621R25美國(guó)America124蘭天15Lantian15甘肅Gansu

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥基因組DNA提取 采用水培法將小麥幼苗培養(yǎng)至兩葉一心，剪取各品系小麥幼嫩葉苗約3 g，置于液氮中冷凍并迅速研磨成粉末.參照CTAB法提取該群體小麥基因組DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，用紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)定所提取的DNA在230 nm，260 nm和280 nm處吸光值，檢測(cè)提取的DNA濃度和相對(duì)純度，D260/D230>2且D260/D280>1.8表示沒(méi)有RNA污染.

1.2.2 SNP標(biāo)記分析 小麥基因組DNA送中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行35K基因芯片掃描分析.基因芯片包括35 143個(gè)SNP位點(diǎn)，覆蓋小麥全基因組，其中18 689個(gè)位點(diǎn)具有品種間的多態(tài)性，剔除基因型檢出率小于80%以及最低基因頻率小于5%的SNP 位點(diǎn)，剩余15 947個(gè)SNP位點(diǎn)，用于遺傳多樣性分析.

1.2.3 SNP遺傳多樣性統(tǒng)計(jì) 利用PowermarkerV2.3.5軟件對(duì)具有多態(tài)性的SNP位點(diǎn)進(jìn)行一般統(tǒng)計(jì)量分析，計(jì)算等位位點(diǎn)頻率、等位位點(diǎn)數(shù)目、遺傳多樣性指數(shù)以及多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)等參數(shù)值.在PowermarkerV2.3.5軟件中采用非加權(quán)平均法(unweight pair method using arithmetic averages，UPGMA)，在遺傳相似系數(shù)(genetic similarity，GS)的基礎(chǔ)上，對(duì)該群體材料進(jìn)行分類，并在Figtree軟件中對(duì)聚類圖進(jìn)行編輯.

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥SNP位點(diǎn)遺傳多樣性分析

利用篩選得到覆蓋小麥整個(gè)基因組的具有品種間多態(tài)性的15 947個(gè)SNP標(biāo)記，對(duì)124份小麥抗旱種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)出31 894個(gè)等位變異，每個(gè)位點(diǎn)均檢測(cè)到2個(gè)等位變異.在PowermarkerV2.3.5軟件中計(jì)算得到多態(tài)性SNP等位變異的頻率在0.28～0.97，平均每個(gè)SNP等位變異頻率為0.75；每個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳多樣性指數(shù)在0～0.75，平均每個(gè)位點(diǎn)遺傳多樣性指數(shù)為0.35；每個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性信息量(PIC)在0～0.70，平均每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息量(PIC)為0.31.

2.2 小麥不同基因組水平上遺傳多樣性分析

通過(guò)對(duì)不同基因組遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性SNP標(biāo)記在小麥3個(gè)基因組上分布顯著不同(圖1).其中A、B和D基因組上分別分布了5 010、5 924和5 013個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)，平均每個(gè)基因組等位位點(diǎn)頻率為0.75、0.74和0.77.分析不同基因組遺傳多樣性和多態(tài)性信息量發(fā)現(xiàn)，B基因組遺傳多樣性較高(0.36)，A基因組次之(0.35)，D基因組最低(0.33)；B基因組的PIC(0.32)較高，A基因組(0.31)次之，D基因組最低(0.29).

2.3 小麥不同同源群水平上的遺傳多樣性分析

對(duì)124份小麥抗旱種質(zhì)在不同同源群進(jìn)行遺傳多樣性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SNP標(biāo)記在小麥7個(gè)同源群間分布差異顯著(圖2).其中，第II同源群上分布的標(biāo)記數(shù)目最多(2 945個(gè))，第IV同源群最少(1 579個(gè))，平均每個(gè)同源群上的標(biāo)記數(shù)為2 278個(gè).每個(gè)同源群上SNP標(biāo)記的等位位點(diǎn)頻率為0.72(第Ⅰ同源群)～ 0.79(第Ⅶ同源群)，平均為0.75.多樣性指數(shù)在0.31(第Ⅶ同源群)～0.39(第Ⅰ同源群)，平均為0.35.PIC值在0.27(第Ⅶ同源群)～ 0.34(第Ⅰ同源群)，平均為0.31.由此看出，在小麥同源群間PIC值和遺傳多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為第Ⅶ同源群較低，第I同源群最高.

圖1 小麥種質(zhì)材料不同基因組水平上的遺傳多樣性Figure 1 Genetic diversity of different genomes in wheat accessions

圖2 小麥群體不同染色體同源群水平上的遺傳多樣性Figure 2 Genetic diversity of different homologous groups in wheat population

2.4 小麥不同染色體水平上的遺傳多樣性

由表2看出，小麥每條染色體分布的多態(tài)性SNP標(biāo)記在441(4D)～1079(5B)，平均為759個(gè)；每條染色體上的單個(gè)SNP標(biāo)記等位位點(diǎn)頻率在0.70(1B)～0.81(4D)，平均為0.75；每條染色體上的遺傳多樣性指數(shù)在0.27(4D)～0.41(1B)，平均為0.34；PIC值在0.24(4D)～0.36(1B)，平均為0.31.由此看出，4D染色體的遺傳多樣性指數(shù)較低，而1B染色體的遺傳多樣性指數(shù)較高.

表2 小麥種質(zhì)材料不同染色體水平上的遺傳多樣性

2.5 小麥群體SNP標(biāo)記的UPGMA聚類分析

通過(guò)PowerMarkerV3.2.5計(jì)算得出小麥品種間的平均遺傳相似系數(shù)為0.31，主要分布于0.29～0.36之間，占48.3% (圖3).采用UPGMA法在GS為0.38處將124份種質(zhì)材料分為七類(圖4).第Ⅰ類材料共14份，主要包括北京，甘肅，山東和山西品種；第Ⅱ類材料共33份，主要是北京，甘肅和山西品種，還有部分山東和美國(guó)材料；第Ⅲ類共有11份材料，主要包括山西，北京和甘肅品種；第Ⅳ類共17份材料，包含甘肅，山西，陜西和美國(guó)品種；第Ⅴ類共16份材料，主要有甘肅，山西和河北品種；第Ⅵ類共23份材料，主要是甘肅，山西，河北和美國(guó)材料；第Ⅶ類共9份材料，由甘肅，河北和山西品種組成.從分類情況來(lái)看，地域來(lái)源相同的小麥種質(zhì)，其遺傳基礎(chǔ)較為相似，同時(shí)也具有較為接近的遺傳系數(shù)，因此容易被分到同一類群中.而有些相同地域來(lái)源的小麥種質(zhì)并沒(méi)有聚為同一個(gè)類群，表現(xiàn)出該群體小麥種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的多樣性和復(fù)雜性.

圖3 小麥品種遺傳相似系數(shù)的分布Figure 3 Distribution of genetic similarity of wheat accession

圖4 基于SNP標(biāo)記的小麥種質(zhì)材料NJ 聚類圖Figure 4 Neighbor-joining(NJ) tree for the wheat population based on SNP analysis data

3 討論

利用分子標(biāo)記技術(shù)分析小麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，是闡明小麥遺傳基礎(chǔ)及改良小麥種質(zhì)資源的有效途徑[18].近年來(lái)，SSR等分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外廣泛的應(yīng)用于小麥遺傳多樣性的研究[19-21]，但是利用SNP標(biāo)記技術(shù)分析小麥種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究還相對(duì)較少.本研究通過(guò)選用15 947個(gè)覆蓋小麥全基因組的具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記，對(duì)124份小麥材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析.通過(guò)對(duì)小麥各基因組、同源群以及染色體的遺傳多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在小麥的3個(gè)基因組中，D基因組的遺傳多樣性顯著低于A基因組和B基因組，在小麥的七個(gè)同源群中，第Ⅶ同源群的遺傳多樣性指數(shù)較低，并且在小麥21條染色體中，4D染色體的遺傳多樣性指數(shù)最低.相關(guān)研究表明，在B基因組上存在許多的與產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的基因，因此B基因組獲得了較大的遺傳多樣性[22-23]，而D基因組由于在六倍體化的時(shí)候僅有部分Ae.Stragulata品系參與到小麥的多倍體化過(guò)程中，且在六倍體化時(shí)D基因組與A基因組和B基因組未形成四倍體，從而導(dǎo)致小麥D基因組的遺傳多樣性較低[23].在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，山羊草屬種的D基因組與小麥D基因組的遺傳多樣性具有很大的差異，且山羊草屬種的D基因組與小麥D基因組完全同源，因此山羊草屬種D基因組上的抗病，抗逆的優(yōu)良基因可以通過(guò)簡(jiǎn)單的同源重組轉(zhuǎn)入到小麥基因組中，豐富小麥的遺傳多樣性[24].

在聚類分析中發(fā)現(xiàn)，地域來(lái)源相同的小麥種質(zhì)，其遺傳基礎(chǔ)較為相似，同時(shí)也具有較為接近的遺傳系數(shù)，因此容易被分到同一類群中.而有些相同地域來(lái)源的小麥種質(zhì)并沒(méi)有聚為同一個(gè)類群，表現(xiàn)出該群體小麥種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的多樣性和復(fù)雜性.相同地理來(lái)源的小麥種質(zhì)材料也未被完全分到一個(gè)類群中，說(shuō)明地域的差別與聚類的結(jié)果沒(méi)有必然的聯(lián)系，引起這種地域性差異縮小的原因可能是在小麥長(zhǎng)期的選擇或育種過(guò)程中促進(jìn)了種質(zhì)材料間基因的交流[17,19].

遺傳基礎(chǔ)是小麥育種過(guò)程中的一個(gè)重要限制因子，種質(zhì)材料的遺傳基礎(chǔ)狹窄是導(dǎo)致小麥育種工作難以取得突破性進(jìn)展的關(guān)鍵因素[21,25-26].因此，對(duì)群體內(nèi)的種質(zhì)材料進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，在指導(dǎo)小麥育種的工作方面具有重要意義[18,20,27].而現(xiàn)在的小麥育種通常過(guò)于關(guān)注產(chǎn)量性狀而忽視其它優(yōu)異性狀，這導(dǎo)致了小麥遺傳多樣性的喪失，降低小麥品種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性.因此在進(jìn)行育種工作時(shí)通過(guò)引進(jìn)優(yōu)良的親本種質(zhì)材料，提高不同遺傳背景種質(zhì)材料之間的交流頻度，拓寬小麥種質(zhì)材料的遺傳基礎(chǔ)，進(jìn)而突破小麥育種的瓶頸，從而培育出對(duì)環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)的小麥品種.