尚蓉霞，余欣，尤翠翠，何海兵，李娟，武立權(quán)

( 1.安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；3.安徽農(nóng)業(yè)大學生物技術(shù)中心，安徽 合肥 230036)

全球氣候變暖，極端天氣頻繁發(fā)生[1]，增加了中國長江流域夏季高溫熱害天氣的發(fā)生頻率，每年7月中下旬和8月上旬是高溫熱害天氣主要集中發(fā)生期，而在此時間段里水稻正處于幼穗分化期至抽穗揚花期[2].孕穗期是水稻對水分和溫度最敏感的時期[3-5]，此時期高溫熱害會造成水稻花器發(fā)育不全，花粉發(fā)育不良，活力下降[3]；此時期缺水會造成穗粒數(shù)減少、空秕粒率上升、干物重降低，最終導致產(chǎn)量下降[4].因此，有必要開展水稻孕穗期響應高溫、干旱脅迫的生理機制研究.

據(jù)報道，水稻孕穗期水分脅迫會使劍葉CAT活性和結(jié)實粒下降[6]；超級稻在孕穗期干旱脅迫可誘導滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累和抗氧化酶活性升高[7]；水稻孕穗期高溫處理后，葉片光合速率降低，結(jié)實率降低，穗粒數(shù)和千粒重減少，產(chǎn)量下降[8]；干旱脅迫使孕穗期水稻葉片抗氧化酶活性提高[9-10].綜上研究多為干旱或高溫單方面脅迫的研究.然而，植物在響應多種逆境脅迫時具有一定的交叉適應性.例如，高、低溫預處理可增強玉米的抗旱性[11]；鹽、冷和熱預處理也可不同程度增強水稻幼苗耐寒性[12]；干旱可誘導黃瓜幼苗對低溫的交叉適應性[13]；干旱鍛煉可提高水稻的抗寒性[14]；干旱預處理可增強玉米幼苗的耐冷性[15].有關(guān)水稻孕穗期干旱、高溫交叉抗逆性研究較少.因此，本研究在水稻孕穗期設置正常對照、單一干旱、單一高溫以及干旱-交叉脅迫試驗，考察孕穗期干旱-高溫交叉脅迫對水稻劍葉中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性和內(nèi)源激素含量的變化，以及對穗粒數(shù)及結(jié)實率的影響，探討其干旱-高溫交叉適應的生理響應機制，以期為水稻節(jié)水灌溉和大田高溫逆境栽培提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在安徽農(nóng)業(yè)大學生物科技樓人工氣候室進行，以秈稻品種‘Nagina 22’(Oryzasativaaus)為試驗材料.2017年5月26日，挑選籽粒均勻、飽滿的水稻種子，經(jīng)表面消毒、浸種后置于培養(yǎng)皿中在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽；選取發(fā)芽均勻一致的種粒于帶網(wǎng)格的塑料盆(高30 cm，內(nèi)徑25 cm)中，每盆3株，一共72盆，置于人工氣候室培養(yǎng)；盆內(nèi)盛有國際水稻Hoagland營養(yǎng)液(霍格蘭配方，表1)[16]，每3天更換一次營養(yǎng)液；氣候室生長條件為晝/夜溫度為30 ℃/25 ℃，晝/夜光周期為12 h /12 h，相對濕度為75 %，光照強度為3 000 lx.以葉齡余數(shù)法[17]診斷幼穗發(fā)育進程，在劍葉葉耳剛露出時開始脅迫處理，此時大多數(shù)稻穗進入花粉母細胞減數(shù)分裂期[18-19].

表1 Hogland營養(yǎng)液配方

硫酸亞鐵和檸檬酸,分別用純水溶解，溶解以后，混合在一起，用純水定至500 mL.Ⅰ 每升純水中加入母液5 mL，Ⅱ 每升純水中加入母液1 mL，Ⅲ 每升純水中加入母液2.5 mL.營養(yǎng)液pH一般在3左右，需要用NaOH溶液調(diào)至為5.5左右.

Ferrous sulfate and citric acid are respectively dissolved with pure water.After dissolving,mix together and set to 500 ml with pure water.Add 5 ml mother liquor to pure water per liter forⅠ;Add 1 ml mother liquor to pure water per liter for Ⅱ;Add 2.5 ml mother liquor to pure water per liter for Ⅲ.The pH of the nutrient solution is generally about 3,which needs to be adjusted to about 5.5 with NaOH solution.

1.2 試驗設計

本試驗在人工氣候室內(nèi)進行，各處理除溫度和模擬干旱外，其余環(huán)境設置均相同.試驗設置正常生長(CK)、單一干旱(drought treatment， D)、單一高溫(high temperature treatment，H)及干旱-高溫交叉(drought-high temperature cross stress，DH)4個處理.其中，(1)正常對照，Hoagland營養(yǎng)液中不添加PEG-6000，晝夜溫度為25 ℃ /20 ℃；(2)單一干旱處理，在已有文獻[9,43]和前期預備試驗基礎上，明確了10% PEG-6000可使水稻達到中度(干旱脅迫程度，故本研究確定采用10% PEG-6000 Hoagland澆灌模擬中度干旱脅迫，每處理重復 3次，每重復12盆，培養(yǎng)3 d；(3) 單一高溫處理，除人工氣候室晝夜溫度變?yōu)?8 ℃/30 ℃外，其它條件不變[8]，高溫連續(xù)處理3 d ，每處理重復 3次，每重復 6盆.(4)干旱-高溫交叉處理，取經(jīng)干旱處理 3 d的水稻植株，重新以Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)使其恢復供水，待恢復正常后轉(zhuǎn)入高溫( 38 ℃ /30 ℃ )處理 3 d，每處理重復 3次，每重復 6盆.

1.3 取樣與指標測定

脅迫結(jié)束后，各處理隨機各選3盆用來取樣，取劍葉與稻穗(取全長的一半，留中間部分)用液氮速凍，并置于 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?余下的植株讓其正常生長至成熟.成熟期考種，因處理主要在減數(shù)分裂期，對穎花退化和籽粒結(jié)實具有顯著的影響，因此通過成熟期穗數(shù)和結(jié)實率等表型指標評估脅迫處理對水稻農(nóng)藝特征的影響.取上述各處理樣品進行如下生理指標測定.

參照李合生[20]和王學奎[21]的方法，分別采用蒽酮比色法、考馬斯亮藍法和硫代巴比妥酸法測定可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量；用氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，用愈創(chuàng)木酚法測過氧化物酶(POD)活性，用紫外吸收法測過氧化氫酶(CAT)活性.

脯氨酸(Pro)含量用磺基水楊酸法浸提，采用日本日立公司(Hitach)的全自動氨基酸分析儀(L-8900)分離測定.浸提方法如下：準確稱取稻穗0.5 g，液氮研磨，轉(zhuǎn)移到5 mL的離心管中，加入2.5 mL的4%的磺基水楊酸，超聲30 min，取1.5 mL上清液于2 mL離心管中，再用超高速離心機以室溫、12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min，用1 mL注射器取上清液過0.22 μm的微孔水系膜于進樣瓶中，上機.

植物內(nèi)源激素玉米素(ZR)、赤霉素(GA)、生長素(IAA)、水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)采用經(jīng)改良的王艷紅[22]和張玉瓊[23]的高效液相色譜法分離測定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析，并應用Duncan檢驗法進行多重比較，檢測處理間差異顯著性(α=0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱-高溫交叉逆境對水稻劍葉滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由表2可知，單一高溫和干旱脅迫下，孕穗期水稻劍葉中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均顯著高于CK(P<0.05)，其中，可溶性糖含量分別是CK的0.43和0.52倍，可溶性蛋白含量分別是CK的0.62和0.73倍，脯氨酸含量分別是CK的0.42和0.77倍.干旱-高溫交叉處理下孕穗期水稻劍葉中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量進一步地上升，且均顯著高于單一高溫和干旱脅迫和CK(P<0.05)，其中，可溶性糖含量是CK的1.21倍，可溶性蛋白含量是CK的1.15倍，脯氨酸含量分別是CK的1.84倍.說明，水稻孕穗期適度的干旱預處理有利于增強水稻的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高其應對高溫的能力.

表2 不同脅迫處理下水稻劍葉可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的變化

不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05).

Different normal letters show significant differences between treatments at 0.05 level.

2.2 干旱-高溫交叉逆境對水稻劍葉抗氧化酶活性的影響

由表3可知，單一高溫和干旱脅迫下，孕穗期水稻劍葉中抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的活性均顯著高于CK(P<0.05)，其中，SOD活性分別比CK提高6.1%和3.6%，POD活性分別比CK提高16.1%和9.4%，CAT活性分別比CK提高13.7%和9.8%.干旱-高溫交叉處理下孕穗期水稻劍葉中SOD、POD和CAT的活性進一步提高，且均顯著高于單一高溫和干旱脅迫和CK(P<0.05)，其中，SOD活性比CK提高10.1%，POD活性分別比CK提高28.6%，CAT活性分別比CK提高22.5%.說明，水稻孕穗期適度的干旱預處理有利于增強水稻清除活性氧的能力，從而提高其應對逆境的抗性.

表3 不同脅迫處理下水稻劍葉中抗氧化酶活性的變化

不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05).

Different normal letters show significant differences between treatments at 0.05 level.

2.3 干旱-高溫交叉逆境對水稻劍葉膜脂過氧化的產(chǎn)物MDA含量的影響

單一高溫和干旱以及干旱-高溫交叉脅迫處理下，孕穗期水稻劍葉MDA含量均高于CK，而干旱-高溫交叉處理后MDA的含量較單一高溫和干旱處理均顯著(P<0.05)下降，下降幅度分別為36.1% 和22.8%(圖1).結(jié)果表明，水稻孕穗期適度的干旱預處理有利于減輕細胞膜脂過氧化傷害程度.

2.4 干旱-高溫交叉逆境對水稻劍葉內(nèi)源激素水平的影響

表4顯示，在單一高溫、干旱和干旱-高溫交叉3種不同脅迫處理下孕穗期水稻劍葉中IAA、ZA和GA含量較CK均有不同程度的下降，而ABA和SA含量較CK均有顯著提高(P<0.05).干旱-高溫交叉處理水稻劍葉中IAA、ZA、GA、ABA和SA含量較單一高溫和干旱處理又有顯著的提高(P<0.05).其中，IAA含量分別提高25.9%和8.6%，ZA含量分別提高4%和31.1%，GA含量分別提高23.5%和17.4%，ABA含量分別提高58.8%和40%，SA含量分別提高34.9%和25.6%.由此可見，水稻孕穗期適度干旱預處理，有利于植物內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)，尤其是進一步地積累ABA和SA來調(diào)節(jié)自身的生長，從而提高對高溫逆境的抗性.

圖1 不同脅迫處理下水稻劍葉MDA含量的變化Figure 1 The change of MDA content in rice leaf under the different stress treatment

表4 干旱和高溫不同脅迫處理下水稻內(nèi)源激素含量的變化

不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05).

Different normal letters show significant differences between treatments at 0.05 level.

2.5 干旱-高溫交叉逆境對水稻穎花形態(tài)的影響

圖2-A～D表明，正常生長的水稻花藥(A)開裂正常，單一干旱處理(B)和單一高溫(C)水稻花藥部分開裂或開裂不完全，干旱-高溫交叉處理(D)明顯比單一高溫(C)花藥開裂多.說明，適度的干旱預處理可能會緩解高溫對水稻花藥開裂程度的影響.

2.6 干旱-高溫交叉逆境對水稻穗粒數(shù)和結(jié)實率的影響

由圖3-A～B可知，水稻孕穗期進行單一高溫、干旱以及干旱-高溫交叉3種不同處理后水稻成熟期穗粒數(shù)和結(jié)實率均較CK有不同程度的下降.其中，水稻穗粒數(shù)分別降低21.1%、18.4%和8.5%；結(jié)實率分別降低12.9%、10.1%和4.1%.干旱-高溫交叉處理較單一高溫和干旱處理下水稻穗粒數(shù)和結(jié)實率均有顯著的提高(P<0.05).以上結(jié)果表明，適當?shù)母珊殿A處理可提高水稻對高溫的抗性，進而顯著提高水稻穗粒數(shù)和結(jié)實率.

3 討論

植物在生長、發(fā)育過程中常遭遇高溫、低溫、鹽漬以及干旱等不良環(huán)境的影響，且它們之間的影響往往是相互關(guān)聯(lián)的[24].當植物進行某種抗性鍛煉時，不僅增強了對這種逆境的抗性，且還增強了對其它逆境的抗性，即為植物的交叉適應性.植物對多種逆境的交叉適應性被眾多學者所證實，而且也大量應用于生產(chǎn)實踐，并且對植物交叉適應性的機制進行了不少的研究報道[25].研究表明，干旱預處理或鹽預處理可提高水稻幼苗的抗冷性，低溫預處理可提高水稻幼苗的抗旱性[26].短期的干旱預處理提高玉米幼苗對冷、熱、干旱及鹽逆境脅迫的抗性[27].干旱預處理花生幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白及Pro等含量均顯著高于單一脅迫的，從而提高花生幼苗對鹽脅迫的抗性[28].由此可見，交叉適應現(xiàn)象在植物中普遍存在，探討干旱預處理對水稻高溫脅迫的生理響應的研究對高效栽培有重要理論和實踐指導意義.植物的逆境交叉適應是應答逆境的主要表現(xiàn)形式，涉及各種生理響應[29]，其中，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶類和內(nèi)源激素等在逆境脅迫中起到了至關(guān)重要的作用，這些物質(zhì)誘導產(chǎn)生和適量積累對植物獲得交叉適應具有重要意義.

A：正常生長CK；B：單一干旱處理D；C：指單一高溫處理H；D：指干旱-高溫交叉處理DH.A is CK；B is D；C is H；D is DH.圖2 不同脅迫處理下水稻穎花的形態(tài)變化Figure 2 The change of morphology in rice panicle under the different stress treatment

圖3 不同脅迫處理對水稻穗粒數(shù)和結(jié)實率的影響Figure 3 The effect of grain number and seeding setting rate in rice under the different stress treatment

3.1 干旱-高溫交叉逆境對水稻滲透調(diào)節(jié)的影響

首先，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物抵抗逆境中發(fā)揮著重要作用，可通過降低細胞滲透勢來維持細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[30].其中，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當植物受到逆境脅迫時，可通過大量積累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸來提高細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，是植物維持正常生長[31-32].本研究結(jié)果表明，水稻孕穗期經(jīng)適度干旱預處理的水稻通過積累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，增強細胞滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高吸水能力，來緩解高溫對其的傷害，進而提高自身的抗性.從各脅迫處理表現(xiàn)來看，干旱-高溫交叉處理下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累量最多，表明水稻孕穗期適度的干旱預處理有利于增強水稻的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高應對高溫逆境的能力.

3.2 干旱-高溫交叉逆境對抗氧化酶和丙二醛的影響

其次，逆境脅迫下，植物細胞由于大量的生物氧自由基的產(chǎn)生幷積累而受到傷害，這時植物酶促防御系統(tǒng)中的各種酶(SOD、POD和CAT等)的活性被激活，起到清除細胞自由基的作用，從而使細胞膜脂減少過氧化，提高植物對逆境的耐受能力[33-34].孕穗期水稻劍葉中的上述幾種主要酶類在干旱和高溫脅迫處理后均發(fā)生了不同變化.在本研究中水稻劍葉抗氧化酶活性均比正常生長的高，且干旱預處理水稻劍葉響應高溫脅迫下抗氧化酶活性均比單一脅迫處理的高，且膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯下降，結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[35].因此，在水稻孕穗期適度干旱鍛煉增加了抗氧化酶清除活性氧能力，導致MDA含量下降，緩解細胞膜脂氧化，從而可以提高水稻的抗高溫能力，也進一步顯示交叉適應性現(xiàn)象的存在.

3.3 干旱-高溫交叉逆境對水稻內(nèi)源激素的影響

植物內(nèi)源激素在植物的生長發(fā)育以及對逆境的反應中起著重要的作用[36-38].本研究中促進型激素(ZR、GA和IAA)在不同脅迫處理下，含量均有不同程度的下降；而經(jīng)過干旱預處理，這些激素含量相比單一逆境處理均有顯著的提高，從而調(diào)節(jié)水稻自身的生長發(fā)育.ABA作為重要的逆境激素和信號分子，多種逆境脅迫都能夠誘導植物內(nèi)源激素ABA的大量積累，對于提高植物的抗逆性起著重要作用[39-41].本研究中經(jīng)過不同脅迫處理后水稻葉片中的ABA相比CK都有明顯的積累，而經(jīng)過干旱預處理后ABA含量相比單一脅迫處理有顯著的增加，這也表明在水稻孕穗期適度干旱鍛煉可能會通過ABA更多積累，以調(diào)控水稻的某些生理過程，來提高水稻的抗高溫能力.SA是植物體內(nèi)的一種新型激素,也參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育.重金屬、熱、干旱、鹽等逆境能誘導植物體內(nèi)SA的合成,緩解逆境對植物造成的傷害,增加植物的抗性能力[42].本研究中經(jīng)過不同脅迫處理后水稻葉片中的SA相比CK都有明顯的積累，而經(jīng)過干旱預處理后SA含量相比單一脅迫處理的更高，這也表明在水稻孕穗期干旱鍛煉可能會通過SA的更多積累，以調(diào)控水稻的某些生理過程，來提高水稻的抗高溫能力.水稻在逆境脅迫下由于促進型激素Z、GA和IAA含量下降導致其生長發(fā)育受阻；同時抑制型激素ABA和SA的含量上升[43].在孕穗期對水稻適度的干旱鍛煉增強了水稻內(nèi)源激素調(diào)節(jié)能力，在提高水稻對高溫抗性的同時，盡可能地維持水稻正常的生長發(fā)育.

3.4 干旱-高溫交叉逆境對水稻穗粒數(shù)和結(jié)實率的影響

非生物脅迫會使花藥不開裂或開裂不完全，進而導致柱頭花粉數(shù)量減少，可萌發(fā)花粉少，影響受精作用[44].高溫造成水稻減產(chǎn)的主要原因是花藥的開裂度降低，使得散粉量減少，從而導致不育穎花數(shù)增加,導致結(jié)實率降低[45-46].本研究表明，干旱預處理可能會緩解水稻響應高溫脅迫的傷害，在一定程度上降低了花藥不開裂.在產(chǎn)量要素方面，孕穗期水稻受逆境脅迫后，水稻穗粒數(shù)降低，結(jié)實率降低，產(chǎn)量下降.這與石春林等[47-51]研究結(jié)論一致.本研究中得出適度的干旱預處理與單一高溫和干旱脅迫相比，可提高孕穗期水稻對高溫的抗性，進而表現(xiàn)在穗粒數(shù)和結(jié)實率上，穗粒數(shù)和結(jié)實率升高，在一定程度上降低了減產(chǎn).

4 結(jié)論

干旱預處理孕穗期水稻響應高溫脅迫的過程中，可通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量、提高抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)內(nèi)源激素含量的變化來增強對高溫的適應能力，減少不開裂及開裂小的花藥，以最大程度的維持正常生長，增強抗性，使其穗粒數(shù)和結(jié)實率相對于單一高溫和干旱脅迫有顯著的提高，從而降低環(huán)境脅迫帶來的減產(chǎn)風險，但其分子機制仍需進一步研究.