王統(tǒng)苗，張莘，陳博雯，常國斌，白皓，江勇，張揚，王志秀，陳國宏

(1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009；2.揚州大學農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009)

中國是世界上鴨品種遺傳資源最為豐富的國家，但是由于外來品種的大量引入和雜交，許多地方品種資源急劇減少，我國地方鴨品種資源的保種迫在眉睫[1].對我國地方鴨品種遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，了解鴨品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化，可以為保種和制作鴨產(chǎn)品提供新的思路[2].微衛(wèi)星是廣泛存在于真核生物基因組中的短串聯(lián)重復序列，在群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體遺傳分化等方面廣泛使用[3]，目前微衛(wèi)星被用于遺傳多樣性研究方面的報道較多[4-5]，而在群體遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究報道較少[6-7].

張揚等[8]利用12個微衛(wèi)星標記對我國保存的6個鴨品種進行群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)‘臨武鴨’與‘攸縣麻鴨’‘高郵鴨’與‘山麻鴨’和‘廣西小麻鴨’的遺傳距離較近；黃種彬等[9]對‘連城白鴨’‘莆田黑鴨’‘金定鴨’‘山麻鴨’和‘福建番鴨’等5個鴨品種遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)4個河鴨屬品種遺傳距離較近，與‘福建番鴨’親緣關(guān)系較遠；宋衛(wèi)濤等[10]使用微衛(wèi)星對蛋鴨品種遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化進行檢測，發(fā)現(xiàn)11個蛋鴨群體中都存在復雜遺傳基礎(chǔ)的個體.

本研究根據(jù)Pritchard[11]提出的多位點等位基因推斷群體遺傳結(jié)構(gòu)的模型分類法(Model-based clusterm ethod)-Structure程序?qū)?018年新發(fā)現(xiàn)的遺傳資源于‘田麻鴨’和‘潤州鳳頭白鴨’，肉鴨代表品種‘北京鴨’‘櫻桃谷鴨’，藥用品種‘連城白鴨’，肉蛋兼用型品種‘吉安紅毛鴨’共180只進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，利用Fstat(V2.9.3)軟件進行遺傳分化研究，旨為闡明于‘田麻鴨’和‘潤州鳳頭白鴨’與其他4個鴨種的遺傳結(jié)構(gòu)關(guān)系，為地方鴨品種資源開發(fā)利用提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本采集

6個地方鴨品種是‘潤州鳳頭白鴨’(FT)(鎮(zhèn)江天成農(nóng)業(yè)科技有限公司)、‘連城白鴨’(LC)(福建省石獅國家級水禽基因庫)、‘櫻桃谷鴨’(YT)(江蘇益客集團)、‘北京鴨’(BJ)(北京畜牧獸醫(yī)研究所)、‘吉安紅毛鴨’(JA)(江西省吉安紅毛鴨資源保種場)、‘于田麻鴨’(YTM)(新疆于田縣)，公母各15只.

1.2 鴨基因組DNA提取

于鴨翅靜脈處采血，提取基因組DNA用傳統(tǒng)苯酚-氯仿法[12]，測定濃度和純度，稀釋到100 ng/L，于-20 ℃保存.

1.3 微衛(wèi)星位點

選擇16對多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物AJ2725-80、AJ515884、CMO11、AY493256、CMO12、AJ515-898、AY493249、AJ515893、SMO13、AJ515895、AJ-272578、SMO4、AJ272579、AY493295、AJ272577、APL2作為試驗位點.

1.4 STR分型測序

將PCR產(chǎn)物送到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行STR分型測序.在ABI-3730XL DNA測序儀上檢測基因型，GeneMapper4.0軟件生成圖譜文件同時讀出片段長度、峰高、峰面積，同時判斷純合子(單峰)或雜合子(雙峰).

1.5 統(tǒng)計分析

依據(jù)微衛(wèi)星座位核心序列，對測序長度數(shù)據(jù)進行矯正，使用Microsatellite-Toolkit軟件導出Fstat(V2.9.3)和Structure2.0軟件所需的數(shù)據(jù)文件.將數(shù)據(jù)導入Structure2.0軟件，設(shè)群體的假定推斷類別數(shù)K值為2～6，K值為祖先群體.對每個K值，重復運行10 000次，每次在10 000 Burn-in的基礎(chǔ)上運行10 000步.估計的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖由Bar Plot程序獲得；NJ圖由Tree Plot程序獲得，獨立類群圖由Triangle Plot程序獲得.每個K值下，用關(guān)鍵參數(shù)log(Alpha)的實時波動來檢測Structure程序重復運行的連續(xù)性和可靠性.

1.6 統(tǒng)計原理

F-統(tǒng)計量包括總近交系數(shù)(Fit)、群體分化系數(shù)(Fis)、群體內(nèi)近交系數(shù)(Fst)等3個參數(shù).

1-Fst=(1-Fis)×(1-Fit)

式中，Ho：觀察雜合度；Hs：平均期望雜合度.

2 結(jié)果與分析

2.1 等位基因數(shù)目在群體中的分布

16個微衛(wèi)星座位在6個群體中共檢測到141個等位基因，見表1.所有座位在6個鴨群體中檢測到多個等位基因，表現(xiàn)為中高度多態(tài)性.其中，AY493256、AY493295、APL2座位等位基因最多，均為13個；CMO11、SMO13的等位基因最少，均為5個.對于6個鴨群體來說，‘于田麻鴨’的等位基因最多，其次為‘櫻桃谷鴨’‘吉安紅毛鴨’‘潤州鳳頭白鴨’含有的等位基因最少.各個位點的等位基因在6個鴨群體中分布均勻，能較好地反映6個群體的遺傳結(jié)構(gòu)特性.

2.2 F-統(tǒng)計量的估計

表2為16個微衛(wèi)星位點在6個鴨群體的F-統(tǒng)計量，16個SSR座位在6個群體內(nèi)的固定系數(shù)(Fst)在0.049～0.325之間變動，其中位點AJ272578最低，位點AJ272577最高，平均值為0.210；6個群體的個體固定系數(shù)(Fit)的范圍為0.17～0.774，最低的位點仍是位點AJ272578，但最高的位點為SMO13;整個群體的個體的近交系數(shù)(Fis)的范圍為-0.029～0.689，其中位點AJ272580和AJ272577為負值，顯示為雜合子過剩，其他位點都顯示為雜合子缺失.

表1 16個座位上的等位基因數(shù)目及其分布

表2 16個微衛(wèi)星座位在6個鴨群體內(nèi)的F-統(tǒng)計量

平均值來自Jackknife,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

Mean estimates from Jack knife over loci，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001.

2.3 我國地方鴨品種群體類別推斷

在假定群體的類別值K下，用log(Alpha)主要關(guān)鍵參數(shù)的實時波動來檢測運行Structure程序的連續(xù)性和可靠性.由圖2可見，log(Alpha)曲線圖檢測值穩(wěn)定，幅度變化小，說明Structure程序構(gòu)建的群體結(jié)構(gòu)圖穩(wěn)定可靠.運用貝葉斯概率理論(Bayesian theory)，使用Structure程序?qū)Σ蓸拥?80個個體進行鑒定.Structure程序還可以依據(jù)個體基因組分數(shù)推測遷移個體和是否具有復雜遺傳基礎(chǔ)的個體(基因組分數(shù)<0.800).結(jié)果表明，6個地方鴨品種群體概率值，‘于田麻鴨’最低為67.2%，‘連城白鴨’最高為85.3%，其他品種概率值在71.4%～82.2%之間.群體平均基因組分數(shù)分布見表3.‘于田麻鴨’‘北京鴨’和‘櫻桃谷鴨’有遷移個體，‘潤州鳳頭白鴨’‘連城白鴨’和‘吉安紅毛鴨’無遷移個體.

表3 6個群體基因組分數(shù)在推斷類別(K=6)中的分布

2.4 基于Structure程序分析群體間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

圖1顯示，在K=2時，所有個體被Structure程序分為2個亞群，‘潤州鳳頭白鴨’‘連城白鴨’‘于田麻鴨’構(gòu)成一個亞群，‘北京鴨’‘櫻桃谷鴨’‘吉安紅毛鴨’構(gòu)成另一個亞群.當K=3時，6個品種被推斷為3個亞群，此時‘于田麻鴨’被單獨分離出來.當K=4時，‘于田麻鴨’和‘吉安紅毛鴨’分開，形成了2個獨立群體，其他4個群體仍未發(fā)生分離.K=5時，‘潤州鳳頭白鴨’‘北京鴨’‘連城白鴨’‘于田麻鴨’成為獨立類群.當K=6時，‘櫻桃谷鴨’和‘吉安紅毛鴨’各自成為獨立類群，最終形成6個獨立群體.在6個群體獨立類群圖中，K=4時，‘連城白鴨’(Cluster4)和‘櫻桃谷鴨’(Cluster 2)分成2個獨立的類群，見圖3左側(cè)獨立類群分布圖；當K=5時，‘潤州鳳頭白鴨’(Cluster1)和‘連城白鴨’(Cluster4)發(fā)生分離，形成獨立類群，見圖3中間獨立類群分布圖；當K=6時，‘連城白鴨’(Custer4)和‘于田麻鴨’(Cluster6)發(fā)生分離，見圖3右側(cè)獨立類群分布圖.

由Structure程序得到的系統(tǒng)聚類圖(圖4)，‘潤州鳳頭白鴨’‘于田麻鴨’和‘櫻桃谷鴨’聚為一類，‘北京鴨’‘連城白鴨’和‘吉安紅毛鴨’聚為一類.

圖1 Structure程序推斷的群體結(jié)構(gòu)圖 Figure 1 Structure program of population structure

3 討論

3.1 群體內(nèi)遺傳多樣性分析

本文選擇16對微衛(wèi)星位點對我國地方6個鴨品種進行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化研究.16個位點多態(tài)信息含量豐富，能夠顯示這6個品種的遺傳多樣性信息，進而可以描述這6個品種間的遺傳結(jié)構(gòu)關(guān)系.

圖2 Structure運行時的log(Alpha)參數(shù)的時實變化圖 Figure 2 The real-time change of the log (Alpha) parameter of the structure runtime

圖3 各群體的獨立類群分布Figure 3 Distribution of independent groups of each group

圖4 Structure程序構(gòu)建的群體NJ樹Figure 4 The community NJ tree constructed by the Structure program

3.2 群體間的遺傳變異

F-統(tǒng)計量結(jié)果顯示群體間存在明顯的遺傳分化，群體間的遺傳差異有21%來自群體間的差異，79%的變異來自個體間的差異，可能由于這6個品種之間相隔距離較遠，致使其群體間基因分化系數(shù)比較大.此結(jié)果高于宋衛(wèi)濤等[10]計算的11個蛋鴨品種的分化系數(shù)(12%)；低于李慧芳等[13]統(tǒng)計的華東區(qū)鴨品種間的分化系數(shù)(25.65%).

3.3 群體系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

Structure程序以貝葉斯概率理論為基礎(chǔ)，采用馬爾可夫-Monte Carlo模擬算法.當程序運行時，采用混合模型來設(shè)置檢測到的群體的編號K[14].利用Structure程序?qū)ξ覈胤?個地方鴨品種群體進行群體分析，當K=6時，可以明顯地將我國6個地方鴨品種區(qū)分開，說明K=6是最佳K值，這與張揚等[8]的研究結(jié)果一致；獨立類群分布圖可以看出‘連城白鴨’始終可以與其他5個鴨品種分離.NJ圖顯示‘于田麻鴨’和‘潤州鳳頭白鴨’聚為一類，‘于田麻鴨’是新疆地方品種，是由野鴨自然交配而形成,和‘潤州鳳頭白鴨’聚為一類，因為這2種鴨都是由野鴨進化而來；‘北京鴨’與‘櫻桃谷鴨’聚為一類，‘櫻桃谷鴨’是‘北京鴨’與英國當?shù)仄贩N雜交而培育出來的新品種，含有大部分‘北京鴨’的血液，且是肉用型的品種[5]，所以它們聚為一類.

本研究通過16個多態(tài)性較好的微衛(wèi)星位點對中國地方6個鴨品種進行了遺傳結(jié)構(gòu)性和遺傳分化研究，為我國地方鴨品種間的遺傳信息和遺傳關(guān)系提供更準確的依據(jù)，為合理開發(fā)利用并且保存各品種優(yōu)良性狀提供可靠的信息.