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        豬源腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定及致病性

        2019-03-26 01:02:36宋祥軍邱明宇朱雪婷涂健劉紅梅邵穎祁克宗
        關(guān)鍵詞:豬源毒力致病性

        宋祥軍 ,邱明宇,朱雪婷,涂健,劉紅梅,邵穎,祁克宗

        (安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230036)

        腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)能夠引起不同宿主腸外組織的感染,可導(dǎo)致不同宿主發(fā)生腦膜炎、敗血癥以及泌尿系統(tǒng)感染等疾病.對糞便的微生物篩查研究表明,ExPEC是一種腸道菌落,與共生大腸桿菌不同,ExPEC擁有的致病性毒力因子能夠在宿主腸道外引起多種腸外疾病[1-4].近年來,豬源ExPEC的分離率在逐年上升,ExPEC作為養(yǎng)豬業(yè)的主要病原體之一,其引發(fā)的疾病對養(yǎng)豬業(yè)可造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[5].隨著工業(yè)化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬源ExPEC爆發(fā)的增長趨勢已成為我國亟需解決的問題[6].一般對于豬病的防治措施,包括開發(fā)具有良好前景的疫苗和使用合理有效的抗生素[7].目前,臨床上發(fā)生豬源ExPEC感染時(shí),首選的治療方法是使用抗生素.但由于抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的盲目使用,使得豬源ExPEC的耐藥性迅速增加,耐藥譜越來越廣,整體耐藥水平升高,導(dǎo)致臨床上可供使用的有效抗生素越來越少,給臨床治療帶來了很大的困難和挑戰(zhàn).

        本試驗(yàn)通過對安徽省合肥地區(qū)送檢的感染ExPEC仔豬進(jìn)行剖檢,通過無菌操作采集其腸外組織心臟、肝臟等,進(jìn)行細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)與16s rDNA PCR測序鑒定,將確定為豬源ExPEC的菌株進(jìn)行種系發(fā)育分群試驗(yàn)、毒力基因檢測、藥敏試驗(yàn)以及小鼠致病性試驗(yàn),進(jìn)一步了解該病原菌的致病性和流行病學(xué)規(guī)律,以期為該病的預(yù)防和臨床治療提供科學(xué)依據(jù).

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        無菌采集合肥周邊地區(qū)送檢的感染ExPEC仔豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟,大腸桿菌藥敏質(zhì)控株ATCC 25922由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,6~8周齡昆明小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

        LB肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉、瓊脂糖、GelRed核酸染色液、5×TBE均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;麥康凱培養(yǎng)基(MAC)、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)、三糖鐵培養(yǎng)基(Triple Sugar Iron Agar)均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;比濁管購自溫州市康泰生物科技有限公司;革蘭氏染液購自北京索萊寶科技有限公司.

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 豬源腸外大腸桿菌的分離純化與鑒定 將采集的腸道外組織無菌接種于麥康凱培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12~18 h;再挑取紅色圓形菌落接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12~18 h,挑取紫黑色帶金屬光澤的單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化.取純化后細(xì)菌適量涂布于載玻片上,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢[8].將初步鑒定為大腸桿菌的菌落進(jìn)行16S rDNA PCR測序鑒定[16].

        1.2.2 豬源腸外大腸桿菌PCR分群 根據(jù)文獻(xiàn),合成系統(tǒng)進(jìn)化分群有關(guān)基因chuA、yjaA、TspE4C2的引物[9],引物如表1所示,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成.

        表1 目的基因、引物、目的片段大小

        1.2.3 豬源腸外大腸桿菌毒力基因檢測 按GenBank公布的有關(guān)基因序列,合成11對ExPEC的毒力基因[10]:kpsMII、iutA、papC、sfaS、focG、afa、papA、hlyD、fyuA、ireA和vaT,引物序列見表2,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

        表2 毒力基因、引物、目的片段的大小

        1.2.4 藥物敏感試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法對分離到的30株豬源ExPEC進(jìn)行藥敏試驗(yàn).將ExPEC菌株接種于LB固體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3~4 h后,取適量菌液與MH瓊脂培養(yǎng)基混勻,倒板,冷卻、凝固后,貼藥敏紙片,37 ℃培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑,讀取并記錄結(jié)果.

        1.2.5 小鼠致病性試驗(yàn) 分別選取含有3個(gè)以上的毒力基因的菌株(Ex-P3、Ex-P5、Ex-P8、Ex-P14、Ex-P22、Ex-P23、Ex-P24、Ex-P26、Ex-P27、Ex-P30),將66只昆明小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組,每組6只,設(shè)置1組對照組,以菌液濃度為2×107CFU/mL,向小鼠腹腔注射0.5 mL/只,對照組注射PBS緩沖液(0.5 mL/只),注射后觀察記錄1周內(nèi)小鼠的死亡情況.

        1.2.6 菌株Ex-P27基因組圈圖 利用高通量測序技術(shù)對Ex-P27菌株進(jìn)行全基因組測序以獲取基因組序列圖譜,采用 Circos v0.69(http://circos.ca/)軟件進(jìn)行基因組圈圖的繪制,通過基因組圈圖可以更直觀的了解基因在正、反義鏈上的分布情況、基因的GC含量、基因組島、同源基因等信息.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 豬源ExPEC的分離株培養(yǎng)特性以及16S rDNA PCR測序鑒定

        分離的菌株在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形紅色、濕潤光滑菌落;在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈紫黑色帶金屬光澤的圓形菌落;在LB固體培養(yǎng)基上呈灰白色、光滑濕潤的菌落.鏡檢可見菌體被染成紅色、兩端鈍圓、單個(gè)、成對或成鏈狀排列,無芽孢.通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因進(jìn)一步鑒定上述篩選的大腸桿菌,擴(kuò)增片段大小為1 450 bp,經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn),30株菌目的片段大小均與預(yù)期一致(圖1);將PCR產(chǎn)物送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測序,序列結(jié)果在NCBI-BLAST搜索比對,鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97%判定,可以確定篩選的大腸桿菌為豬源ExPEC.

        M:DL2 000 DNA Marker;A:1為陰性對照;2~24為檢測菌株;B:1為陰性對照,2~8為檢測菌株.M:DL2 000 DNA Marker;A:1 for negative control,2~24 for detected strains;B:1 for negative control,2~8 for detected strains.圖1 16s rDNA PCR擴(kuò)增Figure 1 16s rDNA PCR amplification

        M:DL2 000 DNA Marker;A:1~3為菌株1(B1),4~6為菌株2(A),7~9為菌株3(D),10~12為菌株4(B1),13~15為菌株5(D),16~18為菌株6(A),19~21為菌株7(A),22~24為菌株8(D);B:1~3為菌株9(B2),4~6為菌株10(B2),7~9為菌株11(B1),10~12為菌株12(B1),13~15為菌株13(B1),16~18為菌株14(A),19~21為菌株15(D),22~24為菌株16(B1);C:1~3為菌株17(B1),4~6為菌株18(B2),7~9為菌株19(B1),10~12為菌株20(B1),13~15為菌株21(B1),16~18為菌株22(B2),19~21為菌株23(B2);22~24為菌株24(D);D:1~3為菌株25(D),4~6為菌株26(B1),7~9為菌株27(B1),10~12為菌株28(B1),13~15為菌株29(B1),16~18為菌株30(B1),19~21為陰性對照.M:DL2 000 DNA Marker;A:1~3 for strain 1(B1),4~6 for strain 2(A),7~9 for strain 3(D),10~12 for strain 4(B1),13~15 for strain 5(D) ,16~18 for strain 6(A),19~21 for strain 7(A),22~24 for strain 8(D);B:1~3 for strain 9(B2),4~6 for strain 10(B2),7~9 for strain 11(B1),10~12 for strain 12(B1),13~15 for strain 13(B1),16~18 for strain 14(A),19~21 for strain 15(D),22~24 for strain 16(B1);C:1~3 for strain 17(B1),4~6 for strain 18(B2),7~9 for strain 19(B1),10~12 for strain 20(B1),13~15 for strain 21(B1),16~18 for strain 22(B2),19~21 for strain 23(B2);22~24 for strain 24(D);D:1~3 for strain 25(D),4~6 for strain 26(B1),7~9 for strain 27(B1),10~12 for strain 28(B1),13~15 for strain 29(B1) ,16~18 for strain 30(B1),19~21 for negative control.圖2 基因chuA(279 bp)、yjaA(211 bp)、TspE4C2(152 bp)的PCR擴(kuò)增Figure 2 PCR amplification of genes chuA,yjaA and TspE4C2

        2.2 系統(tǒng)發(fā)育分群的分群

        分群結(jié)果顯示,30株豬源ExPEC有4株菌是屬于A群,15株菌屬于B1群,5株菌屬于B2群,6株菌屬于D群.30株豬源ExPEC的系統(tǒng)分群結(jié)果如圖2所示.

        2.3 毒力基因的檢測

        30株豬源ExPEC中,檢測合成的11種毒力基因結(jié)果顯示,vaT、iutA、kpsMII、hlyD、fyuA、ireA、afa7種毒力基因,檢出率分別為70.00%、33.33%、23.33%、20.00%、16.67%、3.33%、3.33%,而papC、sfaS、focG、papA這4種毒力基因并未擴(kuò)增出目的條帶.檢出目的基因片段大小與陽性菌株擴(kuò)增片段大小相符,毒力基因檢測結(jié)果的部分PCR圖,如圖3所示.

        M:DL2 000 DNA Marker;A、B、C、D、E、F、G:1為陰性對照;A為毒力基因afa(594 bp)的擴(kuò)增圖,2~10為檢測樣品,4為檢測出的陽性菌株;B為毒力基因fyuA(787 bp)的擴(kuò)增圖,2~13為檢測樣品,2~5為檢測出的陽性菌株;C為毒力基因ireA(254 bp)的擴(kuò)增圖,2~10為檢測樣品,8為檢測出的陽性菌株;D為毒力基因kpsMII(272 bp)的擴(kuò)增圖,2~9為檢測樣品,6~9為檢測出的陽性菌株;E為毒力基因vaT(1 021 bp)的擴(kuò)增圖,2~10為檢測樣品,3、5、6、8泳道為檢測出的陽性菌株;F為毒力基因iutA(314 bp)的擴(kuò)增圖,2~9為檢測樣品,2、4、7泳道為檢測出的陽性菌株;G為毒力基因hlyD(904 bp),2~10為檢測樣品,4泳道、6~9泳道為檢測出的陽性菌株.M:DL2 000 DNA Marker;A,B,C,D,E,F(xiàn),G:1 for a negative control;A:amplification of virulence gene afa (594 bp),2~10 for a test sample,4 for detection of the positive strain;B:amplification map of the virulence gene fyuA (787 bp),2~13 for the test sample,2~5 for the positive strain detected;C:for the expansion of the virulence gene ireA (254 bp) ,2~10 for the detection of samples,8 for the detection of positive strains;D:amplification of the virulence gene kpsMII (272 bp),2~9 for the detection of samples,6~9 for the detection of positive strains;E:amplification map of the virulence gene vaT (1 021 bp),2~10 for the detection sample,lanes 3,5,6,and 8 for the positive strains detected;F:the amplification of the virulence gene iutA (314 bp),2~9 shows the samples tested,lanes 2,4 and 7 for positive strains detected;G:virulence gene hlyD (904 bp),2~10 for the test sample,lanes 4 and 6~9 for detected the positive strain.圖3 毒力基因的PCR檢測Figure 3 The result of PCR detection of virulence genes

        2.4 藥敏試驗(yàn)

        對分離到的30株致病性大腸桿菌進(jìn)行的常用22種抗生素的敏感性試驗(yàn),結(jié)果表明分離株對受試藥物存在不同程度的多重耐藥性,其中對氨芐西林、林可霉素、多西環(huán)素、利福平、桿菌肽的耐藥率最高,達(dá)到100%,對多粘菌素B的耐藥率最低為0%,但敏感率最高為93.33%,對米諾環(huán)素的中介率最高為63.33%,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示.

        2.5 致病性試驗(yàn)

        將本試驗(yàn)中臨床分離到的含有3個(gè)及以上毒力基因的豬源ExPEC菌株腹腔注射接種小鼠,連續(xù)觀察1周的發(fā)病小鼠死亡情況為:Ex-P3(2/6)、Ex-P5(1/6)、Ex-P8(1/6)、Ex-P14(1/6)、Ex-P22(3/6)、Ex-P23(2/6)、Ex-P24(2/6)、Ex-P26(1/6)、Ex-P27(3/6)、Ex-P30(2/6),對照組(0/6).死亡率最高的為Ex-P22和Ex-P27組小鼠,而Ex-P27組小鼠發(fā)病癥狀更嚴(yán)重,表現(xiàn)為采食量下降、行為能力減弱、顫抖、精神萎靡不振,被毛雜亂,因此選擇此菌株做測序驗(yàn)證.

        表3 30株豬源腸外致病性大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)

        2.6 菌株Ex-P27基因組圈圖

        對菌株Ex-P27的高通量測序結(jié)果,預(yù)測到4 995個(gè)編碼基因,其總長5 365 154 bp,平均長度1 074 bp.非編碼RNA預(yù)測中,rRNA有9個(gè),分布在7個(gè)家族;tRNA有86個(gè),分布在22個(gè)家族.利用已預(yù)測到的基因組信息,如重復(fù)序列、GC含量等,應(yīng)用Circos v0.69(http://circos.ca/)軟件繪制出菌株Ex-P27基因組圈圖(圖4).由外向內(nèi)第2圈和第3圈上,不同的顏色標(biāo)識CDS不同的COG的功能分類,第5圈向外的紅色部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量,相反地,向內(nèi)的藍(lán)色部分表示GC含量低于平均水平,峰值高低表示與平均GC含量差值大小.如圖4所示,紅色和藍(lán)色部分交替頻繁,但峰值相近,說明該菌株GC含量波動(dòng)頻繁,但波動(dòng)幅度不大.

        圖4 Ex-P27分離株基因組圈圖Figure 4 Genome circle map of Ex-P27 strain

        3 討論

        豬源ExPEC現(xiàn)已成為威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一,本研究分離到的豬源ExPEC來源于合肥周邊送檢的病豬,通過無菌采集病豬的腸道外的組織分離到的細(xì)菌,經(jīng)純化培養(yǎng)及PCR測序鑒定分離了30株豬源ExPEC.

        大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化群是采用兩步三重PCR,根據(jù)基因chuA、yiaA和TspE4序列將種系發(fā)育群分為4個(gè)群,分別為A、B1、B2、D.本試驗(yàn)結(jié)果顯示,30株豬源ExPEC,B1群菌株為最多,其次是B2和D群,A群所占菌株最少.有研究報(bào)道,不同種群的毒力和致病性不同[11],并發(fā)現(xiàn)對人具有致病性的ExPEC主要是B2群的菌株,D群的致病性次之.A群和B1群的菌株多是屬于共生型的,一般情況下不致病.ExPEC的致病性主要是通過某些毒力因子和宿主的相互作用,導(dǎo)致宿主發(fā)病.本試驗(yàn)選取11種豬源ExPEC的毒力基因,用于進(jìn)一步驗(yàn)證種系發(fā)育群和毒力基因之間的關(guān)系,選取的毒力基因主要包含P-菌毛基因PapA、PapC;S菌毛:sfa;FIC菌毛:foc;非菌毛粘附素:afa;鰲鐵蛋白受或外膜蛋白受體體:iutA、ireA屬于攝鐵系統(tǒng);莢膜多糖基因:kpsMII素;分泌的毒素:α-溶血素hly;毒力島基因vaT;HPI核心區(qū)主要結(jié)構(gòu)基因fyuA.有一些研究者認(rèn)為從腸外組織中分離到的大腸桿菌都可以定為ExPEC,也有些學(xué)者認(rèn)為當(dāng)分離到的菌株中含有2個(gè)及其以上的毒力基因時(shí),便可認(rèn)為是ExPEC.本研究中針對11種毒力基因的檢測結(jié)果顯示,vaT、hlyD、iutA、kpsMII、fyuA、ireA、afa的檢出率較高,分別為:70.00%、20.00%、33.33%、23.33%、16.67%、3.33%、3.33%.Zhu等研究發(fā)現(xiàn)從中國分離的64株豬ExPEC的ompA,fimH,vat,traT和iutA非常普遍[10],其中vat、iutA基因與我們的研究相一致.vaT是1種自轉(zhuǎn)運(yùn)體液泡毒素,與ExPEC腎臟感染有關(guān),且在APEC感染禽肺臟和氣囊過程中表達(dá)量升高[12-14];Highland等研究發(fā)現(xiàn)莢膜多糖基因kpsMII在從小貓肺臟分離的ExPEC中有表達(dá)[15];人源致病性ExPEC的fyuA基因檢出率達(dá)到65.6%,而犬和貓的致病性ExPEC檢出率高達(dá)80%[16-17];研究發(fā)現(xiàn)APEC的iutA缺失株與野生型相比,致病性明顯降低[18];其中毒力基因fyuA在UPEC中檢出率高達(dá)78%,fyuA突變株的毒力低于野生型[19-20].小鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,致病能力最強(qiáng)的菌株均含有毒力基因iutA、fyuA以及毒力基因vaT,其中fyuA、vaT是毒力島基因.馬增軍等[21]報(bào)道在分離到的豬源ExPEC中,檢測到含有毒力基因ler、astA、irp2、fyuA和iutA的菌株中,同時(shí)含有iutA、fyuA基因,且毒力島基因ler的菌株致病力最強(qiáng),本試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示,同時(shí)含有ireA、fyuA、vaT基因的菌株致病能力也很強(qiáng).

        本試驗(yàn)分離到的豬源ExPEC菌株,某些菌株的抗生素的耐藥情況非常嚴(yán)重,豬源ExPEC對多西環(huán)素的耐藥率可高達(dá)100%,這一結(jié)論與王斌等[22]的報(bào)道相吻合,對氨芐西林、復(fù)方新諾明的耐藥率也高達(dá)90%以上,這與何瑩等[23]的報(bào)道基本吻合.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多粘菌素B對豬源ExPEC具有較好的抑菌效果,且豬源ExPEC對頭孢吡肟較為敏感,但對頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢唑林等頭孢類藥物敏感性次之,這與張青嫻[24]的報(bào)道有所差異.2009年四川省規(guī)?;B(yǎng)殖場豬源大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明的耐藥率分別為100.00%、100.00%、96.09%,本試驗(yàn)分離的30株豬源ExPEC對氨芐西林的耐藥率達(dá)到了100%,對阿莫西林以及復(fù)方新諾明的耐藥率也分別達(dá)到了93.3%、90.0%;為了調(diào)查豬源ExPEC的耐藥性,張青嫻、徐引娣等在2016~2017年間分離了59株ExPEC,并對20種常用抗生素進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn),其研究結(jié)果顯示:對復(fù)方新諾明的耐藥率高達(dá)100%,對利福平、鏈霉素、慶大霉素的耐藥率也高達(dá)80%以上,本試驗(yàn)的藥敏結(jié)果為,利福平、鏈霉素、慶大霉素的耐藥率分別為100%、53.33%、76.67%.米諾環(huán)素、磷霉素對ExPEC具有較好的抑菌效果,但有些個(gè)別菌株對米諾環(huán)素、磷霉素不敏感,氨基糖苷類除大觀霉素外,其余藥物對腸外致病性大腸桿菌的抑菌效果都不明顯,對磺胺類、林可胺類以及四環(huán)素類等抗生素也都呈現(xiàn)了不同程度的耐藥性,且大部分菌株都呈現(xiàn)了10重以上的耐藥,且大都表現(xiàn)為多重耐藥.大多數(shù)抗生素對豬源ExPEC已經(jīng)不起作用,或者作用不大,呈現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性,因此,在臨床治療時(shí)對抗生素的選擇一定要慎重,并且要把人用藥與獸用藥物區(qū)分開,盡量避免交叉用藥.在治療疾病的過程中,要針對性用藥,不應(yīng)盲目使用抗生素[25].本試驗(yàn)進(jìn)一步說明了豬源ExPEC的耐藥率之高,耐藥譜之廣泛,因此,在臨床生產(chǎn)實(shí)踐中,一定要合理用藥,以降低ExPEC的耐藥性.

        4 結(jié)論

        本研究從臨床病例分離豬源大腸桿菌,經(jīng)鑒定30株為豬源ExPEC,分群鑒定確定主要分布在B1群,耐藥性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離菌株對氨芐西林、林可霉素、多西環(huán)素、利福平、桿菌肽的耐藥率達(dá)到100%,毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)主要毒力基因?yàn)関aT、iutA、kpsMII、hlyD.致病性試驗(yàn)中死亡率最高的為Ex-P27分離株,經(jīng)過高通量測序獲得了基因組圖譜.本試驗(yàn)通過對豬源ExPEC進(jìn)行的部分生物學(xué)特性和致病性研究,為指導(dǎo)豬源ExPEC的防治與臨床用藥提供依據(jù).

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