李 冉, 歐 杰,3*, 代啟虎, 馬晨晨

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)菌株由本實(shí)驗(yàn)室從四川礦區(qū)周圍重金屬污染嚴(yán)重區(qū)域的泡菜樣品中分離、鑒定并保存。

1.1.2 試劑 MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯，美國Sigma公司；重鉻酸鉀(優(yōu)級純)、Pb(NO3)2(分析純)、Cu(NO3)2(分析純)、 Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)、Cr標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 mg/mL)、Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 mg/mL)等其他試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 火焰原子分光光度計(jì) (TAS-990，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；臺(tái)式酸度計(jì)(PHS-210E,杭州陸恒生物科技有限公司)；離心機(jī)(XZ-6G，湘智離心機(jī)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱(LRH-150F，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；振蕩培養(yǎng)箱(ZQLY-300，上海知楚儀器)。

1.2 方法

1.2.1 16S rDNA 菌種鑒定 將泡菜中分離得到的菌種P1提取DNA，送至生工生物工程(上海)股份有限公司做雙向測序。將測序結(jié)果在 Gen- Bank 中通過 Blast 進(jìn)行基因比對，獲得相似度最高的序列，與測定序列通過Clustal X 進(jìn)行多重序列比對，比對結(jié)果通過 MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 鉛、鉻和銅儲(chǔ)備液的配制 稱取56.579 g 重鉻酸鉀、15.985 g Pb(NO3)2和29.516 g Cu(NO3)2，分別溶于1 L無菌蒸餾水中, 配制為重金屬離子濃度為10 g/L的母液，用0.45 μm的濾膜過濾并于4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存，以備后期吸附使用。

1.2.3 菌株的最小抑制濃度 (MIC) 測定 參考楊振興等[11]的方法，采用MIC方法表征乳酸菌對重金屬離子的耐受性。此方法可以直觀地反映微生物對重金屬的耐受性,且方便比較。如Muoz等[12]利用MIC方法表征工業(yè)廢水中分離得到的微生物對Pb2+、Zn2+等離子的耐受性。實(shí)驗(yàn)重金屬包括Pb2+、Cr6+和Cu2+，測試重金屬的濃度梯度為0.1、 0.5、1.0、 1.5、 2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0 和32.0 mmol/L,每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將分離得到的植物乳桿菌接種在MRS平板中, 生化培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)48 h, 用接種環(huán)挑取單菌落懸浮在0.5 mL滅菌超純水中，取1環(huán)懸浮液中的菌體在不同濃度的3種重金屬平板上劃線培養(yǎng)48 h，設(shè)置無重金屬離子對照組，觀察菌株的生長情況并記錄MIC。

1.2.4 菌體收集及吸附 將分離得到的植物乳桿菌接種在MRS固體培養(yǎng)基上， 36 ℃培養(yǎng)48 h, 挑取單菌落接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中， 36 ℃培養(yǎng)18 h， 4 745×g離心10 min后，收集菌體，用已滅菌超純水4 745×g洗滌，重復(fù)3次，懸浮成100 g/L的菌懸液。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1 000×10-6)、鉻和銅標(biāo)準(zhǔn)溶液 (500×10-6) 配制成濃度為0、20.0×10-6、40.0×10-6、60.0×10-6、80.0×10-6和100.0×10-6的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 用火焰原子分光光度計(jì)測其吸光度值, 以配制的標(biāo)準(zhǔn)液的濃度作為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出吸光度值與濃度的一元線性回歸方程。

1.2.6 單因素吸附條件設(shè)定 植物乳桿菌對Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果測定，分別研究了溶液初始濃度、吸附時(shí)間、菌體用量和初始pH對3種重金屬離子吸附效果的影響。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：①溶液pH值對吸附的影響：將100 mg/L 的Pb2+溶液、Cr6+溶液 和Cu2+溶液,用0.5 mol/L HNO3或0.5 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，各加入菌體,使菌體濃度為1 g/L，36 ℃振蕩吸附8 h，離心后除去菌體，測定上清液中離子濃度。②菌體用量對吸附的影響：在100 mg/L 的Pb2+溶液、Cr6+溶液 和Cu2+溶液中,分別加入菌體，使菌體濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L,于36 ℃、pH值為6的條件下振蕩吸附8 h，離心除去菌體，測定上清液中離子濃度。③離子初始濃度對吸附的影響：在分別為10、20、50、75、100 和150 mg/L的Pb2+溶液、Cr6+溶液和Cu2+溶液中，各加入菌體，使菌體濃度為1 g/L，于36 ℃、pH值為6的條件下振蕩吸附8 h，離心后除去菌體，測定上清液中離子濃度。 ④時(shí)間對吸附效果的影響：在濃度為100 mg/L 的Pb2+溶液、Cr6+溶液 和Cu2+溶液中,分別加入菌體,使菌體濃度為1 g/L，于36 ℃、pH值為6的條件下振蕩吸附1、2、4、8、12、16、20和24 h后離心，去除菌體，收集上清液，放入4 ℃冰箱內(nèi)，統(tǒng)一測定上清液中離子濃度。

1.2.7 儀器工作參數(shù)設(shè)定及樣品的測定 火焰原子吸收分光光度計(jì)測定鉛、鉻、銅，所需條件如下:波長分別為228.8、359.3和324.8 nm, 狹縫0.15～0.2 nm, 燈電流4.0 mA, 燃?xì)饬髁? 500 mL/min, 背景校正為氚燈。在測定標(biāo)準(zhǔn)液相同的實(shí)驗(yàn)條件下，吸取吸附后的上清液注入原子分光光度計(jì)中，平行測定3次。如果測定結(jié)果已超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，則用1%硝酸溶液稀釋至范圍內(nèi)后再重新進(jìn)行測定。按以下公式計(jì)算鉛、鉻和銅的生物吸附率:

式中，Qr：吸附率(%)，C0：金屬離子初始濃度(mg/L)，Ce：吸附后重金屬離子最終濃度(mg/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA菌種鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)室所分離得到的菌株提取基因組 DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物均在 1 500 bp 左右，條帶清晰且無雜帶，可用于菌株16S rDNA 序列的測定。測序結(jié)果在 NCBI 基因序列數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行 Blast 序列比對，將同源性較高的菌株用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。篩選菌株P(guān)1與幾株Lactobacillusplantarumstrain 具最高的序列同源性，結(jié)合菌株的形態(tài)、生理生化特征說明從泡菜中分離出的菌株P(guān)1屬于植物乳桿菌。

2.2 MIC測定結(jié)果

由植物乳桿菌的MIC 測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，該植物乳桿菌對不同重金屬的耐受程度具有顯著的特異性。對3組最低抑制濃度數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS進(jìn)行Qne-way ANOVA分析，結(jié)果如表1所示。3種重金屬離子比較，其對Pb2+具有最大耐受性， MIC 為(6.67±1.155) mmol/L；其次是Cu2+，MIC為(2.17±0.764) mmol/L；Cr6+的最低抑制濃度最小，為(0.67±0.28) mmol/L 。

表1 植物乳桿菌的最小抑制濃度(mmol/L)

注：P<0.05，不同字母表示不同金屬間具有顯著性差異

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/L, 以鉛離子的濃度作為橫坐標(biāo),以樣品的吸光度值作為縱坐標(biāo), 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:y=0.018 2x+0.029 0, 擬合度R2=0.997 2。

鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0、20.0、40.0、60.0、80.0和100.0 mg/L, 以鉻離子的濃度作為橫坐標(biāo), 以樣品的吸光度值為縱坐標(biāo), 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:y=0.008 1x+0.032 4, 擬合度R2=0.993 2。

銅標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0、1.5、3.0、4.5、6.0和7.5 mg/L, 以銅離子的濃度作為橫坐標(biāo), 以樣品的吸光度值為縱坐標(biāo), 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:y=0.066 4x+0.034 5, 擬合度R2=0.993 7。

圖1 基于菌株 16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.4 單因素對Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果影響

2.4.1 pH對Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果影響 pH值為影響微生物細(xì)胞外聚合物(EPS, 指附著在細(xì)菌表面或圍繞在細(xì)菌周圍,用于自我保護(hù)和相互黏附的有機(jī)物質(zhì))吸收重金屬的重要因素之一[13]。 圖2為pH值對3種重金屬離子吸附效果的影響，由于pH為中堿性范圍時(shí)部分溶液會(huì)產(chǎn)生沉淀，本實(shí)驗(yàn)選取了2～6的pH作為研究范圍。結(jié)果表明，pH對3種重金屬離子的吸附均有較大的影響，其中Pb2+的影響最明顯，Pb2+在pH為4時(shí)吸附率最高，達(dá)到了55%，該現(xiàn)象是由于在pH 值較低時(shí)，溶液中H+的含量增加，H+會(huì)與金屬離子競爭結(jié)合位點(diǎn)；同時(shí)，細(xì)胞表面攜帶的官能團(tuán)會(huì)被質(zhì)子化，導(dǎo)致正電荷增加，從而使重金屬離子的吸附量減少。pH 升高時(shí)，可以暴露出更多的磷酸基、羧基等負(fù)電基團(tuán)，與帶正電荷的金屬離子結(jié)合，使得吸附量增加。但當(dāng)溶液 pH 增加到一定程度時(shí)，金屬離子也會(huì)形成氫氧化物沉淀，從而降低了吸附率。而本實(shí)驗(yàn)所測條件下，Cr6+和Cu2+在pH為6時(shí)達(dá)到吸附最高峰，此時(shí)吸附率分別為38%和12%。同一pH下對3種重金屬的吸附效果不同，因?yàn)橹参锶闂U菌的胞壁上最多的蛋白是S-層蛋白，它含有多種負(fù)電荷的官能團(tuán)，能選擇性地結(jié)合金屬離子。Schut等[14]利用蛋白酶 K將保加利亞乳桿菌的 S-層蛋白處理掉后，其結(jié)合銅、鐵的量減少了，而鋅和錳的結(jié)合率則上升。Comte等[15]的研究中也發(fā)現(xiàn)微生物吸附中，EPS結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量在不同pH下會(huì)有差異，而且菌體對不同重金屬的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量也不同。因此，選取Pb2+、Cr6+和Cu2+的最適pH為4、6和6。

2.4.2 菌體濃度對Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果影響 圖3為菌體用量對3種重金屬離子吸附效果的影響。結(jié)果顯示，隨著菌體用量的增加，菌體對3種離子的吸附率提高，尤其在1～3 g/L區(qū)間，Pb2+和Cu6+的吸附率有明顯的提升，而Cr6+的吸附率變化不大，Cr6+在3～6 g/L的菌體用量時(shí)，吸附率增加較快。在6 g/L時(shí)，菌體對3種離子的吸附均已達(dá)到平衡，為Pb2+、Cr6+和Cu2+的最高吸附率分別為96%、61%和49%。這是由于隨著菌量的增加，導(dǎo)致了吸附位點(diǎn)增加,使得去除率升高，但是吸附率并不會(huì)隨菌體用量的增加而成比例提高，菌體過量導(dǎo)致了吸附率下降，這種現(xiàn)象可能是由于生物量過大時(shí)，部分菌體細(xì)胞產(chǎn)生絮凝作用[16]，使得菌體本身無法充分分散在吸附體系中，反而減少了吸附位點(diǎn)以及吸附的表面積，從而使得吸附率平穩(wěn)或降低。但考慮到經(jīng)濟(jì)效益問題，本研究選用最佳菌體用量為3、6和5 g/L。

圖3 菌體質(zhì)量濃度對Pb2+、Cr6+和Cu2+吸附率的影響 Fig.3 Effect of bacteria concenstration on the adsorption rate of Pb2+,Cr6+ and Cu2+

2.4.3 Pb2+、Cr6+和Cu2+初始濃度單獨(dú)吸附效果影響 圖4為各重金屬初始離子濃度對吸附效果的影響。結(jié)果表明，隨著初始濃度的升高，重金屬離子的吸附率均降低，但吸附量會(huì)有所增加。在10～30 mg/L之間，吸附率下降最快，50 mg/L后吸附速率下降均減慢。這是因?yàn)檩^高的初始離子濃度使得菌體與底物之間發(fā)生相互作用的可能性更大，導(dǎo)致了底物的吸附量隨濃度的增加而增加的現(xiàn)象。但當(dāng)菌體的重金屬結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量一定時(shí)，濃度升高，結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)趨近飽和，過量的重金屬離子不能被吸附，結(jié)合率逐漸又下降,有研究[17]表明過高的重金屬離子迫使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能破壞較嚴(yán)重，致使細(xì)胞膜通透性增加。在150 mg/L的初始濃度下，3種重金屬離子的吸附率均已不足20%， 因?yàn)镻b2+、Cr6+和Cu2+的量已經(jīng)多于細(xì)胞表面的吸附位點(diǎn),因此3種重金屬離子被吸附的百分比較低。本研究確定Pb2+、Cr6+和Cu2+的最優(yōu)初始離子濃度分別為100、100和50 mg/L。

2.4.4 接觸時(shí)間對Pb2+、Cr6+和Cu2+的單獨(dú)吸附效果影響 微生物吸附重金屬過程一般情況可分為兩個(gè)階段。反應(yīng)初期時(shí)，由于細(xì)胞表面存在大量的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致該階段的金屬離子可以被快速吸附。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，吸附率的增加逐漸變緩，金屬被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，最終達(dá)到平衡，該階段可稱為生物積累。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的不斷增加，菌體表面的吸附活性位點(diǎn)已經(jīng)逐漸達(dá)到飽和，吸附的過程中還可能存在部分解析現(xiàn)象。由圖5可以看出，Cr6+與Pb2+和Cu2+相比更早的達(dá)到吸附平衡，在4 h左右時(shí)吸附穩(wěn)定，后期趨于平穩(wěn)。隨后8 h左右時(shí)，Cr6+達(dá)到吸附平衡，而Pb2+在16 h 才達(dá)到吸附穩(wěn)定期，原因可能是植物乳桿菌的結(jié)合位點(diǎn)可以快速高效的結(jié)合Cr6+，而對Pb2+和Cu2+的吸附在第一階段相對于Cr6+吸附較為緩慢，后者吸附主要是發(fā)生在第二階段。因此，本研究確定Pb2+、Cr6+和Cu2+的最佳吸附時(shí)間為12、2和8 h。

圖4 Pb2+、Cr6+和Cu2+的初始濃度對吸附效果的影響 Fig.4 The effect of initial concentration of Pb2+，Cr6+ and Cu2+ on the adsorption effect

圖5 接觸時(shí)間對吸附Pb2+、Cr6+和Cu2+的影響 Fig.5 The effect of contact time on the adsorption ofPb2+，Cr6+ and Cu2+

3 討 論

目前所報(bào)道的對重金屬具有較高耐受性的微生物大部分是從環(huán)境中篩選得到的，很少從食品中分離得到。本研究從泡菜中篩選得到的對重金屬Pb2+、Cr6+和Cu2+具有較高耐受性的菌株P(guān)1，通過對其形態(tài)特征、生理生化性質(zhì)鑒定表明菌株P(guān)1與菌株鑒定手冊中植物乳桿菌的描述較為接近。16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建揭示了菌株P(guān)1與植物乳桿菌親緣關(guān)系較近，因此，綜合菌株的形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列分析結(jié)果，認(rèn)為分離到的菌株P(guān)1是1株植物乳桿菌。

測定3種重金屬離子對該菌的最小抑制濃度，使用原子吸收方法測定不同條件下該植物乳桿菌對重金屬Pb2+、Cr6+和Cu2+吸附效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該植物乳桿菌對3種重金屬離子的吸附效果有顯著差異，但與其對3種重金屬的耐受性并沒有正相關(guān)的關(guān)系，其耐受性為Pb2+>Cu2+>Cr6+，而吸附效果為Pb2+>Cr6+>Cu2+。與已有報(bào)道[8-9]一致，如翟齊嘯[20]的研究中，干酪乳桿菌CCFM30，雖然具有較好的鎘吸附能力，但對鎘的MIC僅為50 mg/L，這可能是由于MIC與重金屬吸附的作用機(jī)制不同導(dǎo)致的。本研究中，該植物乳桿菌對Pb2+的最優(yōu)單因素吸附條件為吸附時(shí)間12 h、菌體用量3 g/L、pH 4、初始鉛離子濃度100 mg/L，吸附率最高可達(dá)96%；對Cr6+的最佳吸附條件為吸附時(shí)間4 h、菌體用量6 g/L、pH 6、初始鉻離子濃度100 mg/L，吸附率最高可達(dá)69%；對Cu2+的最佳吸附條件為吸附時(shí)間8 h、菌體用量5 g/L、pH 6、初始鉻離子濃度100 mg/L，吸附率最高可達(dá)49%。該植物乳桿菌是一種高效安全Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附劑，在今后含乳酸菌食品及飼料制劑的開發(fā)應(yīng)用中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。而在消化道中多種因素的共同影響下，該菌能否發(fā)揮其有效的脫除作用仍需進(jìn)一步探索。