謝嘉木

摘 要：SNPs分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種比較理想的一種DNA標(biāo)記技術(shù)。本文簡(jiǎn)要介紹SNPs分子標(biāo)記的特點(diǎn)、基本原理，以及其在魚類遺傳圖譜構(gòu)建、性狀關(guān)聯(lián)分析等方面的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：SNPs;魚類;遺傳圖譜;性狀關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）03-0203-02

1 SNPs概述

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）是指在基因組DNA序列中因單個(gè)堿基突變導(dǎo)致的多態(tài)性。常見的突變類型有單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失。假設(shè)一種等位基因頻率在群體中不小于1%時(shí)，即可認(rèn)定為SNP。在SNP的堿基突變類型中，轉(zhuǎn)換與顛換的頻率比為2：1，插入和缺失突變較少。并且轉(zhuǎn)換多以CT為主，出現(xiàn)這種突變的原因主要是甲基化大多發(fā)生在CpG島上的殘基C上，C殘基極易發(fā)生脫氨基化而轉(zhuǎn)變?yōu)門，因此CpG島自然而然成為了突變熱點(diǎn)。從理論水平上來講，SNPs應(yīng)該涉及到三種多態(tài)型：二、三和四等位基因多態(tài)性，但實(shí)際上后兩個(gè)是極其稀少的，因此SNPs也常被稱為二等位基因（或二態(tài)）遺傳標(biāo)記。廣泛分布于基因組中的SNPs主要有兩種類型：第一類分布在基因的非編碼區(qū)，第二類分布在基因的編碼區(qū)（Coding SNPs，cSNPs）。第一類SNPs不會(huì)改變蛋白質(zhì)序列，也不會(huì)使個(gè)體呈現(xiàn)出突變的表型，卻又被廣泛應(yīng)用于群體的遺傳變異、物種進(jìn)化等研究中。第二類cSNPs又可分為同義cSNPs和非同義cSNPs兩種類型。同義cSNPs產(chǎn)生的表現(xiàn)型與第一類分布在基因非編碼區(qū)的SNPs相似，而非同義cSNPs會(huì)對(duì)呈現(xiàn)出來的性狀產(chǎn)生影響，如：改變基因編碼的氨基酸序列，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能改變，最終改變其表現(xiàn)型，這種SNPs我們稱之為錯(cuò)義cSNPs。此外，cSNPs會(huì)提前突變成終止密碼子，使得蛋白翻譯過程提前終止，進(jìn)而影響蛋白的功能，呈現(xiàn)與原本不同的表現(xiàn)型，這種SNPs我們稱之為無義cSNPs?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，在使蛋白質(zhì)序列發(fā)生變化的cSNPs中，其中非同義cSNPs占20%左右。識(shí)別和鑒定一個(gè)種群內(nèi)所有個(gè)體間的SNPs及其差異性，將能有效獲得不同個(gè)體生長(zhǎng)狀態(tài)、抗病力及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力等相關(guān)信息，為魚類遺傳育種實(shí)踐提供理論參考，具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

2 SNPs特點(diǎn)

SNPs特點(diǎn)主要有：（1）密度高。所有動(dòng)植物的基因組中都廣泛存在大量的SNPs，如：在魚類中，平均每302bp長(zhǎng)度的序列中就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SNP。（2）具備高的遺傳穩(wěn)定性。SNP的形成就是使單個(gè)核苷酸堿基發(fā)生改變，其突變頻率還是比較低的，因此，跟其它多態(tài)性分子標(biāo)記（如：微衛(wèi)星）相比，其遺傳穩(wěn)定性就高。（3）代表性強(qiáng)。深入研究那些引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的cSNPs，有助于我們解析某些疾病的發(fā)生機(jī)制和遺傳機(jī)理。（4）易于檢測(cè)自動(dòng)化：由于SNPs為雙等位標(biāo)記，只需采用“+/-”或“有或無”的分析方式，就可使得基于SNP的檢測(cè)方法易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

3 SNPs檢測(cè)方法

理論上，凡是能檢測(cè)點(diǎn)突變的技術(shù)都可用來檢測(cè)SNP標(biāo)記。目前，研究者已開發(fā)出很多識(shí)別未知或已知SNP位點(diǎn)的方法，每種方法都有它的特點(diǎn)和缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)采用哪種方法要視研究者自身需求和條件而定。下面將介紹比較常見和經(jīng)典的檢測(cè)技術(shù)。

限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）：由于DNA限制性酶切所識(shí)別的核苷酸序列發(fā)生突變，會(huì)增加或減少酶切片段的數(shù)目，所產(chǎn)片段的大小也會(huì)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致出現(xiàn)DNA多態(tài)的現(xiàn)象。具體過程：先用PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)片段，再用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物即可檢測(cè)到變異的SNPs的變異。該方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，缺點(diǎn)是無法高通量檢測(cè)和發(fā)掘SNPs。

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single-strand conformational polymorphism，SSCP）：是指由于單堿基突變而引發(fā)的小片段單鏈DNA三維構(gòu)象的變異而產(chǎn)生的多態(tài)性。流程是變性處理擴(kuò)增獲得的DNA片段，使其形成單鏈。由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性PAGE凝膠中電泳的遷移率就會(huì)不同，通過與標(biāo)準(zhǔn)物的對(duì)比，即可檢測(cè)出是否有SNPs。其優(yōu)點(diǎn)是方便、經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)效率高（80%-90%以上）。

TaqMan探針法（TaqMan Probe）：通過帶有TaqMan 標(biāo)記的PCR引物來擴(kuò)增目的基因片段，再收集和檢測(cè)PCR過程中/后產(chǎn)生的熒光信號(hào)，從而獲得等位基因類型的SNPs，把這種技術(shù)稱之為TaqMan探針法。此方法優(yōu)點(diǎn)是無需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，因此其檢測(cè)速度快;缺點(diǎn)是準(zhǔn)確探針的設(shè)計(jì)。

基因芯片技術(shù)（Gene chip）：基因芯片的測(cè)序原理是在一塊基片表面固定了大量序列已知的靶核苷酸探針，通過雜交、測(cè)序獲得目標(biāo)核酸序列，經(jīng)過信息處理鑒定出SNPs。該方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、迅速、自動(dòng)化的，但其其具有假陽性率高的缺點(diǎn)。

測(cè)序法（DNA sequencing）：直接測(cè)序是識(shí)別SNPs標(biāo)記的最直接和最常用的方法。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)Sanger測(cè)序原理，利用測(cè)序儀來確定待測(cè)分子的DNA序列，通過比較分析進(jìn)而獲得其SNPs位點(diǎn)信息。此方法優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性強(qiáng)，常用來驗(yàn)證其他檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。缺點(diǎn)是樣本檢測(cè)量少，耗時(shí)長(zhǎng)，成本較高。

4 SNPs在魚類遺傳育種學(xué)中的應(yīng)用

4.1 高密度遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜是基因組學(xué)研究中重要的組成部分，是根據(jù)基因組中基因和專一的多態(tài)性標(biāo)記之間的相對(duì)位置而繪制出來的圖譜，顯示所知的基因和/或遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置。遺傳圖譜在基因組結(jié)構(gòu)、功能、進(jìn)化、質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀基因鑒定等方面的研究中被廣泛應(yīng)用。由于SNP可反應(yīng)基因位點(diǎn)的多態(tài)性，因此可用它來構(gòu)建高密度遺傳圖譜。近年來，諸多學(xué)者在基于SNPs來構(gòu)建魚類遺傳圖譜的應(yīng)用研究中取得了較大程度的進(jìn)展。如：王航俊[1]采用10個(gè)SSRs標(biāo)記和11個(gè)SNPs標(biāo)記對(duì)13個(gè)群體共367尾中華烏塘鱧進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，這些SSRs標(biāo)記和SNPs標(biāo)記為不同類群的分類提供了有效的工具。鄭先虎[2]基于高分辨率的SNPs標(biāo)記成功構(gòu)建了鯉的整合圖譜，并與斑馬魚基因組的圖譜進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：鯉與斑馬魚之間存在大量保守區(qū)域。

4.2 性狀關(guān)聯(lián)分析

在常規(guī)育種的基礎(chǔ)上，借助分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，通過分析不同基因型與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析等，可大大減少育種的盲目性。王倩[3]等人分析谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶M基因與魚類低溫耐受性的相關(guān)性時(shí)，運(yùn)用PCR-SSCP 技術(shù)研究了130尾斑馬魚GSTM 基因5-UTR、3-UTR和第一內(nèi)含子序列的SNP，同時(shí)分析了篩選到的基因型與其低溫耐受性狀的關(guān)聯(lián)性。研究結(jié)果表明GSTM基因SNPs位點(diǎn)與斑馬魚低溫耐受性能關(guān)聯(lián)分析提供了依據(jù)，也將為海水經(jīng)濟(jì)魚類抗寒標(biāo)記篩選育種提供參考。王桂興[4]等人以雌核發(fā)育牙鲆（Paralichthys olivaceus）為對(duì)象，根據(jù)GenBank收錄的牙鲆生長(zhǎng)激素基因序列設(shè)計(jì)9對(duì)引物，采用直接測(cè)序法對(duì)50尾雌核發(fā)育牙鲆生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子進(jìn)行了SNPs篩選，共檢測(cè)到7個(gè)SNPs。經(jīng)SNPs與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析后，結(jié)果表明：只有兩個(gè)SNPs位點(diǎn)（C477T和2067T/-del）與牙鲆的體重、體長(zhǎng)、體高等生長(zhǎng)性狀明顯相關(guān)（P<0.05），而其他5個(gè)SNPs位點(diǎn)不存在生長(zhǎng)性狀相關(guān)性（P>0.05）。該結(jié)果將為牙鲆生長(zhǎng)性狀的SNPs標(biāo)記輔助選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 王航俊.基于SSR和SNP標(biāo)記研究我國(guó)沿海中華烏塘鱧的種群遺傳結(jié)構(gòu)[D].廈門大學(xué)，2012.

[2] 鄭先虎.鯉連鎖圖譜及生長(zhǎng)、肉質(zhì)性狀QTL定位研究[D].上海海洋大學(xué)，2012.

[3] 王倩，尤鋒，辛夢(mèng)嬌，等.斑馬魚GSTM單核苷酸多態(tài)性與低溫耐受性的相關(guān)分析[J].海洋科學(xué)，2015，39（1）：1-7.

[4] 王桂興，等.牙鲆GH基因的SNPs與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的初步研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2015，22（2）：347-352.