高行空 苑興君

鴨致病性大腸桿菌（EPEC）感染是鴨個體被致病性大腸桿菌部分或全身感染的疾病。現(xiàn)有本溪地區(qū)的禽病源性大腸桿菌（Avian Pathogenic Escherichia Coli， APEC）的研究數(shù)據(jù)多數(shù)來源于雞，缺乏鴨源EPEC病原特性的系統(tǒng)研究。鴨大腸桿菌病的病理特征多樣、臨床癥狀復(fù)雜、致病菌耐藥性差異大且不同血清型之間可能存在交叉保護。在鴨規(guī)?；曫B(yǎng)過程中，由大腸桿菌感染致死造成的損失較為常見，一直是困擾禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近年來，隨著鴨規(guī)?；B(yǎng)殖逐步形成，禽流感、新城疫等主要疾病得到有效控制，大腸桿菌病因其重視程度差、防止效價低導(dǎo)致和致病性大腸桿菌在抗生素濫用下耐藥性不斷增強，患病率呈明顯上升趨勢。遼寧省本溪地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展迅速，研究本溪地區(qū)鴨源大腸桿菌O15、O35優(yōu)勢血清型之間的交叉保護關(guān)系，確定單血清疫苗免疫保護是否有應(yīng)用價值，以及交叉免疫導(dǎo)致大腸桿菌病變的能力強弱，對鴨大腸桿菌病的科學(xué)免疫有重要意義。

1試驗動物

實驗選用采購于沈陽茂華生物科技有限公司的1周齡雛鴨，飼養(yǎng)1周取健康、敲擊實驗籠反應(yīng)正常的雛鴨45只。

2免疫菌液的制備

一級菌種制備：將篩選出O15和O35二種型菌株，在操作臺上用接種環(huán)涂布于麥康凱瓊脂基上，在37℃恒溫環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)24h，篩選典型菌落于標(biāo)準(zhǔn)瓊脂繼續(xù)培養(yǎng)24h，無菌、低溫環(huán)境備用。

二級菌種制備：將一級菌轉(zhuǎn)移到普通肉湯，37℃連續(xù)震蕩24h。吸取培養(yǎng)后菌液與普通瓊脂以1：1比例混合后在37℃再克氏瓶中培養(yǎng)24小時。用0.9%NaCl溶液沖洗克氏瓶，經(jīng)無菌紗布過濾后無菌、低溫環(huán)境備用。

活菌計數(shù)：無菌條件下，移取二級菌種液lmL，按1：10逐步稀釋，按常規(guī)平板計數(shù)法使二級菌種液活菌含不低于1×1010 個/mL。

滅活：將二級菌懸液中加入0.4 %甲醛溶液，在37℃環(huán)境中靜置3d，每6～8h攪拌混勻。

內(nèi)毒素檢測：移取0.1mL鱟試劑置于10×75mm玻璃試管中，便震蕩邊滴加0.1mL滅活菌液，在37℃水浴中放置1h，觀察結(jié)果。

3氫氧化鋁佐的制備

在60℃溫度下，移取8%氧化鋁溶液44mL，與42mL 4%的氫氧化鈉溶液攪拌混合，至出現(xiàn)鋁膠凝聚。調(diào)整pH至5.6～6.0，高溫滅菌2h后與二級菌液1：1混合，無菌、低溫環(huán)境備用。

4免疫菌液的檢驗

物理檢驗：肉眼觀菌液顏色，混懸狀態(tài)等。

無菌檢驗：將制備好的二級菌液分別經(jīng)過T.G、GA、GP，檢查是否有菌落出現(xiàn)。

安全性檢驗：選取10只1周齡雛鴨，經(jīng)腹部皮下注射0.2mL滅活菌液，記錄10d內(nèi)雛鴨健康狀態(tài)，如果無不良反應(yīng)則合格。

5方法

5.1大腸桿菌的交叉保護研究

隨機選取2周日齡雛鴨35只，分7組每組5只，每只經(jīng)腹部皮下注射免疫菌液0.2mL。每組雛鴨分籠飼養(yǎng)，所用雛鴨接觸實驗器材分組使用，觀察1周后進行二次免疫，方法與初次免疫相同，觀察1周。二次免疫后，對雛鴨感染攻毒株菌液0.2mL/只。記錄發(fā)病時間、死亡時間。繼續(xù)飼養(yǎng)1周，頸椎脫臼法殺死所有雛鴨，無菌采集心臟和肝臟，分組情況為：

A組：初次和二次免疫苗為O15免疫株，用O15毒株感染，觀察雛鴨健康狀態(tài)。

B組：初次和二次免疫苗為O35免疫株，用O15毒株感染，觀察雛鴨健康狀態(tài)。

C組：初次和二次免疫為安慰劑，用O15毒株感染，觀察雛鴨健康狀態(tài)。

D組：初次和二次免疫苗為O15免疫株，用O35毒株感染，觀察雛鴨健康狀態(tài)。

E組：初次和二次免疫苗為O35免疫株，用O35毒株感染，觀察雛鴨健康狀態(tài)。

F組：初次和二次免疫為安慰劑，用O35毒株感染，觀察雛鴨健康狀態(tài)。

G組：空白組，初次和二次免疫為安慰劑，用安慰劑感染，觀察雛鴨健康狀態(tài)。

5.2試驗結(jié)果

未經(jīng)免疫的雛鴨在感染O15和O35毒株后全部死亡;接受O15免疫后的雛鴨在感染O15毒株后個體健康無病變，在感染O35后全部死亡;接受O35免疫后的雛鴨在感染O35毒株后個體健康無病變，在感染O15后全部死亡;空白對照組雛鴨無死亡，剖檢觀察相應(yīng)器官無病變。

5.3討論

試驗表明，單一免疫苗只對相應(yīng)的毒攻株有免疫作用，但是對于不同的血清型的菌株無免疫作用，進一步證實了O15和O35之間無在交叉保護影響。因此，由于大腸桿菌在養(yǎng)殖場中多種血清型混合生長，單一菌的免疫不能滿足養(yǎng)殖場廣泛免疫的要求。建議本溪地區(qū)鴨養(yǎng)殖場在大腸桿菌免疫時，使用O15和O35的多價疫苗。經(jīng)過雛鴨解剖，我們還發(fā)現(xiàn)雖然免疫苗對于不同的血清型的菌株無免疫作用，但接受過免疫個體被毒攻后的病征明顯弱于未經(jīng)免疫的雛鴨。

本試驗還考慮到細菌內(nèi)毒素的干擾。細菌內(nèi)毒素是大腸桿菌細胞壁上特殊結(jié)構(gòu)脂類，在受到特異性激活時分泌特殊遞質(zhì)，控制中性粒細胞釋放熱源。在交叉保護試驗中內(nèi)毒素可能引起內(nèi)毒素休克，出現(xiàn)內(nèi)循環(huán)紊亂，體內(nèi)酸中毒。本試驗前的鱟試驗和安全性驗證已經(jīng)保證滅活的菌液中內(nèi)毒素全部去除。

所分離的鴨致病性大腸桿菌O15，O35優(yōu)勢血淸型在雛鴨上不存在交叉保護。

（作者單位：117000遼寧省本溪市農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展服務(wù)中心）