朱妍麗，田婧楠，劉斌，羅潔，任發(fā)政，李媛，文鵬程

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

Pickering乳液是指固體顆粒吸附在兩種不相容液體界面上，通過改變空間位阻或界面及連續(xù)相的流變學(xué)特性來穩(wěn)定的乳狀液[1]，用于穩(wěn)定Pickering乳液的固體顆粒稱為Pickering顆粒，它具有比普通小分子表面活性劑更高的穩(wěn)定性、抗聚結(jié)性和安全性等特性[2-4].常用的Pickering顆粒有無機(jī)或有機(jī)粒子，如二氧化硅[5]、氧化石墨烯[6]、殼聚糖[7]等.但是，無機(jī)粒子穩(wěn)定的Pickering乳液的生物降解能力和生物相容性會限制其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，例如鋰皂石，蒙脫石，粘土等粒子的不可食用性使其難以應(yīng)用于食品體系中[8].近年來，很多研究報(bào)道用大豆蛋白[9]、脂質(zhì)、淀粉納米顆粒[10]穩(wěn)定Pickering乳液.然而，由蛋白質(zhì)、淀粉多糖等形成的Pickering乳液易被胃腸液所破壞，并在胃腸道中發(fā)生相分離.此外，由蛋白質(zhì)和淀粉穩(wěn)定的皮克林顆粒產(chǎn)率較低，成本也很高.因此，亟須開發(fā)穩(wěn)定應(yīng)用于食品體系且成本較低的Pickering顆粒乳化劑.

纖維素(Cellulose)來源廣泛，成本低，具有較高生物可降解性和兼容性，是一種環(huán)境友好型的可再生資源[11]，其在胃腸道中也不易被消化，是一種制備乳液較好的材料.纖維素是由D-吡喃葡萄糖環(huán)彼此以β-( 1，4) 糖苷鍵連接而成的線型高分子化合物，較差的水溶性阻礙了其在很多領(lǐng)域中的應(yīng)用.因此，需要通過對纖維素改性提高水溶性，從而改變其在乳液水相中的潤濕性，制備穩(wěn)定的Pickering乳液.

現(xiàn)有的很多改性方法缺乏對反應(yīng)位點(diǎn)的選擇性和反應(yīng)的隨機(jī)性，從而導(dǎo)致纖維素氧化度較低，并且其溶解度有限.據(jù)報(bào)道，TEMPO氧化可以在水溶液中選擇性地氧化纖維素C6位伯羥基，所得到的納米纖維結(jié)晶度、強(qiáng)度及比表面積都有很大的改變[12-13].該方法也在我們之前的研究中得到了很好的應(yīng)用.Li等[14-16]利用TEMPO氧化法制備了不同氧化度的氧化多糖微凝膠，應(yīng)用于溶菌酶、花色苷和β-胡蘿卜素的包埋.基于組成纖維素的每個(gè)葡萄糖基環(huán)上均有3個(gè)羥基，這3個(gè)羥基在多相反應(yīng)中有著不同的反應(yīng)活性[17]，因此可以利用TEMPO /NaBr / NaClO體系對纖維素進(jìn)行定點(diǎn)氧化改性，增加其水溶性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍.

本研究采用廢樹枝提取出的微晶纖維素為主要原料，對其進(jìn)行TEMPO氧化，以期增加纖維素納米晶水溶性，并通過掃描電鏡、穩(wěn)定性分析儀、電位滴定儀、傅里葉紅外光譜對其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征與分析；利用改性后的纖維素納米晶制備水包油型Pickering乳液，確定制備Pickering乳液的最適氧化度，并初步探究Pickering乳液在制備復(fù)乳以及包埋益生菌方面的潛在應(yīng)用價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

次氯酸鈉(NaClO)、溴化鈉(NaBr)、丙酮(CH3-COCH3)、鹽酸(HCI)、硼氫化鈉(NaBH4)、溴化鉀(KBr)、PGPR(Poly-Glycerol-Poly-Ricinoleate)、氯化鈣(CaCl2)均為分析純，購置于阿拉丁試劑有限公司；氫氧化鈉(NaOH)(分析純，達(dá)瑞化學(xué)品有限公司)；纖維素(阿拉丁試劑有限公司)；2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)(Sigma)；棕櫚果油(食品級，中糧集團(tuán)福臨門)；尼羅紅、Super-green-1(色譜純，Sigma)；乙醇(分析純，九鼎化學(xué)試劑公司)，試驗(yàn)所用超純水為實(shí)驗(yàn)室自制.

1.2 主要儀器與設(shè)備

低速臺式大容量離心機(jī)(TDL-5C型，上海安亭公司)；磁力攪拌器(CL-1A型，上海一科儀器有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(LCJ-10型，北京松源華興科技有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9076A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速剪切機(jī)(T-25 basic型，德國IKA公司)；穩(wěn)定性分析儀(Turbiscan TOWER型，法國Formulation公司)；傅里葉紅外光譜儀(Nicolet iS50型，賽默飛世爾科技有限公司)；共聚焦激光顯微鏡(TCS SP5型，德國Leica)；掃描透射電鏡SEM(SU9000型，日立公司)；納米粒度及Zeta電位儀(SZ-100型，日本HORIBA).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 TEMPO氧化纖維素納米晶的制備 參考前人方法并有所改進(jìn)[18].首先，準(zhǔn)確稱取2 g纖維素于盛有200 mL水的燒杯中，利用磁力攪拌器使纖維素均勻分散在水中，再分別稱取0.013 g TEMPO和0.05 g溴化鈉，溶于少量水中，加入到上述溶液中，調(diào)節(jié)溶液的pH為10.向上述溶液中加入pH為10的NaClO溶液，在反應(yīng)過程中逐滴加入0.5 mol/L NaOH以維持溶液的pH=10.當(dāng)溶液的pH不再降低時(shí)，繼續(xù)加入NaClO溶液，直至消耗掉制備不同氧化度纖維素納米晶所需的NaOH溶液.再添加2 mL乙醇，5 min之后加入0.05 g硼氫化鈉，磁力攪拌1 h后調(diào)pH為3，磁力攪拌1 h后再調(diào)pH至7，繼續(xù)攪拌1 h.并在攪拌狀態(tài)下加入一定量的乙醇終止反應(yīng)，靜置1 h后離心，乙醇洗3次，丙酮洗1次，真空冷凍干燥或在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干.采用此法分別在10、20 ℃下制備了氧化度為30%(DO30)、50%(DO50)和100%(DO100)的纖維素納米晶.

1.3.2 Pickering乳液的制備 采用剪切乳化法制備Pickering乳液[19].分別稱取5 mg的纖維素原料、DO50、DO100 粉末溶解于5 mL去離子水中，分散均勻.攪拌狀態(tài)下加入500 μL的棕櫚果油，混勻，將裝有混合液的燒杯用高速剪切機(jī)在17 370 r/min轉(zhuǎn)速下剪切5 min，得到不同氧化度纖維素穩(wěn)定的Pickering乳液.

1.3.3 W/O/W型乳液的制備 W/O乳液制備(內(nèi)相)：稱取100 mg PGPR溶于5 mL棕櫚果油中，加入500 μL超純水，置于10 mL小燒杯中，用高速剪切機(jī)在27 980 r/min轉(zhuǎn)速下剪切5 min，制得W/O乳液內(nèi)相.

W/O/W乳液制備：稱取氧化度為50%的氧化纖維素納米晶5 mg，溶于裝有5 mL超純水的離心管中，混合使其完全溶解.再加入第1步制得的W/O乳液內(nèi)相，用高速剪切機(jī)在20 610 r/min轉(zhuǎn)速下剪切3 min，制得W/O/W乳液.

1.3.4 Pickering乳液包埋菌的制備 采用剪切乳化的方法制備包埋乳酸乳球菌的Pickering乳液.包埋細(xì)菌選取轉(zhuǎn)基因乳酸乳球菌NZ900，選用DO50纖維素納米晶做穩(wěn)定劑，將菌體均勻分散在2 mL棕櫚果油中，用漩渦震蕩混合器混合均勻.其他步驟同1.3.2的制備方法.

1.3.5 掃描電子顯微鏡(SEM)分析 將干燥的纖維素原料、DO50、DO100粉末粘到掃描電鏡的導(dǎo)電膠上，噴金，通過場致發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)以5 mm工作距離和5 kV加速電壓對制備的樣品進(jìn)行掃描.

1.3.6 TEMPO氧化纖維素的水溶性分析 將溶有等量微晶纖維素、DO50、DO100粉末(8 mg)的超純水樣品分別裝入透明玻璃瓶中拍照觀察，對比氧化前后纖維素的溶解性變化.

1.3.7 傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)表征 分別取200 mg的溴化鉀和2 mg樣品(纖維素原料、DO50、DO100)于研缽中，用研磨棒順時(shí)針研磨，研細(xì)后將兩者混合均勻，用紅外壓片機(jī)壓成透明的薄片(厚度在0.5 mm左右)，壓力為60 kN，時(shí)間4 min.用傅里葉紅外光譜儀分別對纖維素原料、DO50、DO100 3種樣品進(jìn)行紅外掃描.數(shù)據(jù)用Origin 8.0軟件處理.

1.3.8 Zeta電位分析 稱取適量的纖維素原料、DO50和DO100粉末，用超純水適當(dāng)稀釋之后，在25 ℃下用馬爾文激光粒度儀測量Zeta(ζ)電位.每個(gè)樣3次平行.

1.3.9 激光共聚焦顯微鏡對Pickering乳液的表征 制備好的Pickering乳液中的氧化纖維素用正電荷熒光染料super-green-1染色后，取適量滴于載玻片中央，488 nm激發(fā)波長激發(fā)，520 nm波長下發(fā)射，觀察并拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 TEMPO氧化纖維素納米晶的產(chǎn)率

不同溫度下氧化得到的纖維素納米晶產(chǎn)率如圖1所示.10 ℃條件下，氧化度為30%和50%的纖維素納米晶產(chǎn)率分別為10%和9.83%，而20 ℃的氧化度為50%和100%的纖維素納米晶高于10 ℃時(shí)的產(chǎn)率，分別為80%和75%.試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)10 ℃條件下氧化耗時(shí)最久，平均15 h以上，而且氧化度越高耗時(shí)越長，產(chǎn)率極低.

圖1 TEMPO氧化產(chǎn)率Figure 1 The yield of TEMPO oxidation

2.2 TEMPO氧化纖維素納米晶的形貌特征

圖2所示為未氧化的微晶纖維素和不同氧化度下的纖維素納米晶的掃描電鏡結(jié)果圖.未氧化的微晶纖維素結(jié)構(gòu)致密，而氧化度為30%，50%和100%的纖維素納米晶呈細(xì)纖維狀，而且隨著氧化度的增大，纖維結(jié)構(gòu)變得更加疏松.這可能是因?yàn)檠趸仍礁?，結(jié)晶區(qū)破壞越明顯，纖維素納米晶結(jié)構(gòu)就越松散.

2.3 TEMPO氧化纖維素的水溶性分析

試驗(yàn)對比了纖維素原料和不同氧化度的纖維素納米晶的水溶性.由圖3可知，未氧化的微晶纖維素不溶于水(左)，形成乳白色的懸濁液.這是因?yàn)槔w維素原料中含有的伯羥基基團(tuán)容易形成分子間和分子內(nèi)氫鍵，會覆蓋一部分羥基對水的親和作用，使得纖維素不溶于水.與DO100纖維素納米晶水溶液相比，DO50纖維素納米晶水溶液有略微渾濁現(xiàn)象，而DO100纖維素納米晶水溶液澄清透明，說明其水溶性最好.TEMPO氧化使微晶纖維素結(jié)構(gòu)解體變成疏松易于分散的單體，而且羧基含量決定纖維的水分散性[20]，氧化度越高，纖維素的水溶性就越大.也有學(xué)者用水溶液光學(xué)圖來表示試樣的水分散性，以水溶液的澄清度來進(jìn)行判斷[21].纖維素原料的Zeta電勢為-2.6 mV(表1)，羧基的引入導(dǎo)致DO50和DO100纖維素納米晶Zeta電勢分別為-54.18、-58.52 mV.

圖2 纖維素原料、DO30、DO50和DO100的掃描電鏡圖(SEM)Figure 2 SEM image of cellulose raw materials,DO 30,DO50 and DO100

圖3 纖維素原料(左)、DO50(中)和DO100(右)的水溶性Figure 3 The watersolunility of cellulose(left),DO50(middle) and DO100 (right) aqueous solution

2.4 紅外光譜(FTIR)分析

纖維素原料、DO50和DO100的傅里葉紅外分析結(jié)果如圖4所示.氧化后的纖維素納米晶C-6醇羥基被氧化成羧基，對稱伸縮震動νs=1 600 cm-1為羧基的碳氧雙鍵吸收峰，νs=1 390 cm-1為羧基的碳氧單鍵吸收峰，這表明纖維素已被成功地氧化.而且DO50和DO100隨著氧化度的增加，它們的羧基吸收峰面積也隨之增大，說明氧化度越大纖維素所含的羧基量越多.我們之前對TEMPO氧化魔芋進(jìn)行紅外表征也得到類似紅外圖譜，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氧化后，氧化多糖上的羧基吸收峰明顯增強(qiáng)，證明羥基成功氧化為羧基[22].

表1 纖維素原料、DO50和DO100的Zeta電勢

圖4 纖維素原料、DO50和DO100的紅外吸收光譜Figure 4 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of cellulose，DO50 and DO100 polymers

2.5 氧化纖維素納米晶制備Pickering乳液形態(tài)分析

圖5所示分別為用纖維素原料、DO50、DO100制備的O/W型Pickering乳液的熒光顯微鏡照片.纖維素納米晶被綠色染料Super-green-1標(biāo)記，且Super-green-1在488 nm波長光激發(fā)下顯示綠色熒光.由圖5可知，未經(jīng)過氧化的纖維素?zé)o法形成球狀的Pickering乳液液滴，由于油水分層而只捕捉到熒光標(biāo)記的微晶纖維素(圖左).油相并未被染色，由DO50和DO100纖維素納米晶制備的Pickering乳液液滴呈現(xiàn)綠色光環(huán)，說明纖維素納米晶吸附在油水界面形成Pickering乳液，而且DO50和DO100形成的乳滴大小不一，并分散在水中.潤濕性是固體粒子形成Pickering乳液的最重要的特性之一[23]，氧化后的纖維素納米晶表面潤濕性提高，能形成產(chǎn)率較高的O/W型Pickering乳液.

圖5 纖維素原料、DO50和DO100制備的乳液熒光顯微鏡圖Figure 5 Fluorescence micrograph of cellulose,DO50 and DO100 Pickering emulsion

2.6 Pickering乳液的穩(wěn)定性比較分析

圖6所示為用纖維素原料、DO50、DO100制備的Pickering乳液放置0、24、48 h后的穩(wěn)定性對比圖.由圖6可知，未經(jīng)氧化的微晶纖維素制備的Pickering乳液放置24 h后開始出現(xiàn)分層現(xiàn)象，48 h后有明顯的分層；而DO50、DO100制備的Pickering乳液在48 h后并未出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象.用穩(wěn)定性分析儀分析24 h之內(nèi)乳液的穩(wěn)定性變化及分層情況(圖7)，也可以看出纖維素原料制備乳液(上)很快就出現(xiàn)了分層，說明未氧化的微晶纖維素難以形成Pickering乳液，而DO50(中)和DO100(下)Pickering乳液的穩(wěn)定性總體無太大差別.

圖6 纖維素原料、DO50、DO100制備的Pickering乳液穩(wěn)定性比較Figure 6 Stability comparison of Pickering emulsion prepared from cellulose raw materials,DO50 and DO100

圖7 纖維素原料、DO50和DO100Pickering乳液放置24 h分層示意圖Figure 7 Schematic diagram of cellulose raw materials,DO50 and DO100 Pickering emulsion placed for 24 h

2.7 W/O/W型乳液的制備

根據(jù)之前對Pickering乳液形態(tài)及穩(wěn)定性的分析，我們選擇了氧化度為50%的纖維素納米晶作為之后應(yīng)用的對象.為便于觀察DO50是否成功制備出W/O/W型乳液，選用尼羅紅對油相進(jìn)行染色，之后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察分析.尼羅紅在488 nm激發(fā)波長下激發(fā)顯示紅色.由圖8(左)可知，乳液中間黑色部分為內(nèi)水相，紅色發(fā)熒光部分為油相，外部黑色部分為外水相，可以判斷出DO50纖維素納米晶能夠作為外水相乳化劑，成功應(yīng)用于復(fù)乳的制備中.圖8(右)為3D層掃圖，可以明顯看到DO50纖維素納米晶制備的W/O/W型乳液的結(jié)構(gòu).

圖8 DO50纖維素納米晶制備W/O/W型乳液的共聚焦顯微鏡圖Figure 8 Confocal microscopy of W/O/W emulsion prepared by DO50 cellulose nanocrystals

2.8 Pickering乳液對菌體包埋的影響

菌體的熒光標(biāo)記一直是難點(diǎn)之一，應(yīng)用基因工程方法將表達(dá)熒光的蛋白整合到菌體的基因中，便可以永久的標(biāo)記菌體，也便于可視化檢測和定量檢測.如圖9所示，包埋用到的菌體經(jīng)過轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)入質(zhì)粒PNZ11Red，可產(chǎn)生紅色熒光蛋白，在共聚焦顯微鏡下自發(fā)紅色熒光.圖10所示為用DO50纖維素納米晶Pickering乳液包埋菌體的結(jié)果，可以看到，產(chǎn)紅色熒光的菌體成功包埋在乳液中，形成微球，可以證明氧化纖維素納米晶制備的Pickering乳液能夠用于菌體包埋.

圖9 自發(fā)熒光乳酸乳球菌共聚焦顯微鏡圖Figure 9 Fluorescence confocal microscopy of spontaneous fluorescent Lactococcus lactis

圖10 Pickering乳液包埋菌體熒光共聚焦顯微鏡圖Figure 10 Fluorescence confocal microscopy of emulsion encapsulating the bacterial

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明不同的溫度下，不同氧化度的纖維素納米晶產(chǎn)率不同.可能是因?yàn)槔w維素分子中有大量的氫鍵，加上其較高的結(jié)晶度，導(dǎo)致了纖維素的氧化反應(yīng)難以進(jìn)行，耗時(shí)較長[24].升高氧化溫度可能破壞了纖維素分子的部分氫鍵作用和結(jié)晶的完善程度，使氧化劑更容易進(jìn)入纖維素內(nèi)部，氧化活性提高，因而氧化產(chǎn)率提高.隨著氧化度的增高，氧化劑難以進(jìn)入強(qiáng)結(jié)晶區(qū)，導(dǎo)致產(chǎn)率隨氧化度增加而下降.李琳[25]研究不同溫度下微晶纖維素選擇性氧化產(chǎn)物性能時(shí)，也得到了相同的趨勢.TEMPO氧化過程中選擇性的將纖維素多糖C-6醇羥基氧化成羧基，極大地減弱了分子內(nèi)部的氫鍵作用，破壞了纖維素的結(jié)晶區(qū)，產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)較為疏松的氧化纖維素納米晶.而且氧化度越高，羧基數(shù)量增加，纖維素納米晶水溶性增強(qiáng)，羧基數(shù)量的增多也是引起電勢改變的原因.吳波等[26]也用納米纖維素懸浮液的光學(xué)圖像來說明隨著羧基數(shù)量的增多，其水溶液澄清度提高，水溶性變好.

TEMPO氧化的纖維素納米晶能夠制備穩(wěn)定性較好的O/W型Pickering乳液，這與改性后的纖維素納米晶潤濕性有關(guān).一般潤濕性通過油水界面上的三相接觸角θ體現(xiàn)，當(dāng)θ接近90°時(shí)，顆粒在油水兩相分布均衡，因而表現(xiàn)出兩親性，既可以形成O/W 乳液又可以形成W/O乳液[27].Miikka等[28]通過丁胺接枝改性得到兩親性的納米微晶纖維素，制備出穩(wěn)定的O/W乳液；Andresen等[29]對微纖化纖維素進(jìn)行疏水改性后發(fā)現(xiàn)，其可以被用來形成W/O乳液.付偉[30]通過超聲乳化的方法制備了不同氧化度的細(xì)菌纖維素穩(wěn)定的Pickering 乳液，在掃描電鏡下觀察到纖維素分布在液滴表面，其穩(wěn)定性隨纖維用量的增大而增大，隨羧基量的增大反而減小.

生物活性化合物因有抗癌、抗氧化、預(yù)防心血管疾病等功能而越來越受人們的關(guān)注，而加工貯存過程中環(huán)境會對活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和利用度造成不利影響，對于益生菌等口服傳遞的活性因子而言，pH、胃腸酶、粘液等都是影響其活性穩(wěn)定性的限制性因素.因此包埋可以有效增加有益菌的胃液穩(wěn)定性，提高存活率，包埋可以保護(hù)菌體免受不良環(huán)境因素的影響，發(fā)揮其生物活性功能.本研究證明氧化纖維素納米晶制備的Pickering乳液成功包埋了菌體，其在菌體包埋中有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

4 結(jié)論

本研究通過TEMPO氧化成功制備出了不同氧化度(DO30、DO50、DO100)的纖維素納米晶，使其水溶性得到了極大地提升.氧化后的纖維素納米晶能夠制備出穩(wěn)定性較好的Pickering乳液，并證明了氧化纖維素納米晶穩(wěn)定的Pickering乳液可以用于制備W/O/W型復(fù)乳以及益生菌的包埋.但目前對于Pickering乳液的體外消化及菌體存活率情況還未進(jìn)行深入的探究，該體系也需要進(jìn)一步的完善，這些研究內(nèi)容可以作為今后研究的重點(diǎn).