李麗梅，馮云霄，何近剛，程玉豆，關(guān)軍鋒

（河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北石家莊050051）

酚類物質(zhì)是果酒的重要組成部分，賦予果酒復(fù)雜的口感和味感特征[1]，同時具有抗氧化的生理功能[2]，葡萄酒中多酚類物質(zhì)具有極強的抗氧化、抗菌與預(yù)防心腦血管疾病等生理功效[3]。對果酒自身還具有抑菌[4]、抗氧化和澄清的作用[5]，便于果酒的保存和品質(zhì)改善。關(guān)于果酒酚類物質(zhì)的研究主要集中在葡萄酒方面，內(nèi)容涉及分析[6-8]、種植環(huán)境[9]、采收期[10]、酵母[11]、提取方法[12]、發(fā)酵條件[13]等因素對酚類物質(zhì)含量的影響。而關(guān)于梨酒的酚類物質(zhì)則鮮有報道。梨和葡萄自身的酚類物質(zhì)種類和含量有差異[14-17]，可能造成梨酒和葡萄酒中的酚類物質(zhì)不同。目前尚未見到報道梨酒的酚類物質(zhì)含量和種類以及對梨酒品質(zhì)的影響，因此本研究以“雪花”梨為試驗材料，以全果、皮肉和果肉分別榨汁后釀制梨酒，探討不同部位對梨酒中酚類物質(zhì)含量和種類的影響，為原料選擇和優(yōu)化梨酒的釀制工藝提供理論依據(jù)?！把┗ā崩媸呛颖笔〉奶赜衅贩N，栽培面積大，產(chǎn)量高。但隨著新品種梨的不斷引種和推廣，消費者對“雪花”梨的消費量逐年下降，銷售市場低迷，梨賤傷農(nóng)，農(nóng)民的種植積極性極大受挫，給河北省梨產(chǎn)業(yè)帶來不利的影響。為了保護“雪花”梨這一地方品種，需要為其銷售尋找新的突破口。開展釀酒研究將有利于“雪花”梨種植業(yè)的發(fā)展，增加農(nóng)民收入，具有重要的社會和經(jīng)濟效益。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

新鮮“雪花”梨于成熟期采摘自河北省趙縣范莊“雪花”梨種植基地。

酵母RC212：法國LAFFORT公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：J&KScientificLTD；熊果苷（純度≥98%）、沒食子酸（純度≥98%）、綠原酸（純度≥98%）、（+）-兒茶素（純度≥98%）、p-香豆酸（純度≥98%）、槲皮素（純度≥98%）、原兒茶酸（純度≥98%）標準品：北京索萊寶科技有限公司；咖啡酸（純度≥98%）、表兒茶素（純度≥98%）、蘆?。兌取?8%）標準品：北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100分光光度計：美國Unico公司；L-2000高效液相色譜儀（配備L-2400 UV檢測器，Lachrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本 Hitachi公司；3K30高速離心機：美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 梨酒釀制

分別取全果（剔除種子）、皮肉和果肉榨取果汁，調(diào)整糖度至22°Brix，接種酵母RC212，進行酒精發(fā)酵，待糖度不再下降時發(fā)酵結(jié)束，倒罐，靜置，自然澄清，得到3種不同的梨酒，分別命名為WFW、PFW和FW。

1.3.2 酚類物質(zhì)分析

新鮮“雪花”梨采收后分別取全果（剔除種子）、皮肉和果肉立即榨取果汁（分別依次命名為WFJ、PFJ和FJ），10 000×g離心 10 min，取上清液過 Cleanert C18-SPE固相萃取小柱（提前以色譜純甲醇潤洗），然后用色譜純甲醇沖洗，收集淋洗液搖勻，過0.45 μm極性濾膜后，取10 μL進樣，進行高效液相色譜法（high performance liquid chromatograph，HPLC）進行分析。酒液的HPLC分析前的處理方法同果汁。

酚類物質(zhì)分析參考李麗梅等[14]的方法。色譜條件：HITACHI L-2000高效液相色譜儀器自帶的反相LachromC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長280 nm，柱溫30℃，流動相為5%冰醋酸水溶液（A）、乙腈（B）。采用梯度洗脫程序，洗脫程序為0～20 min，5%～15%B，21min～40min，15%～45%B，流速為 1.0mL/min，進樣體積為 10 μL。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測定

參考Takako等[18]的方法。

式中：S為DPPH自由基清除率，%；A0為DPPH甲醇溶液的吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計分析軟件JMP11.0對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)分析

通過與標準品比對，共分離鑒定出10種酚類物質(zhì)見表1，按出峰時間排序，依次是3，4-二羥基苯丙氨酸、熊果苷、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、蘆丁和槲皮素。

表1 不同部位“雪花”梨榨取梨汁的酚類物質(zhì)比較Table 1 Comparison of phenolic among different juice from'Xuehua'Pear

梨果汁中酚類物質(zhì)的總量從高到低依次是WFJ、FJ和PFJ。其中WFJ中熊果苷的含量最高，為83.29μg/mL，綠原酸、蘆丁次之，分別為18.40μg/mL和14.10μg/mL，原兒茶酸含量為 7.26 μg/mL，3，4-二羥基苯丙氨酸、沒食子酸和兒茶素3種酚類含量接近，約4 μg/mL～5 μg/mL，表兒茶素和槲皮素含量在 1μg/mL～2 μg/mL，咖啡酸的含量不足0.5 μg/mL。PFJ中各酚類物質(zhì)含量排序和WFJ相同，但含量低于后者。FJ的酚類物質(zhì)和WFJ和PFJ差異較大，表現(xiàn)為綠原酸的含量最高，為58.55 μg/mL，熊果苷次之，為 38.26 μg/mL，蘆丁和兒茶素分別為 11.87 μg/mL 和 8.28 μg/mL，原兒茶酸含量為4.86 μg/mL，沒食子酸含量為 3.35 μg/mL，3，4-二羥基苯丙氨酸含量為2.36 μg/mL，表兒茶素和槲皮素含量接近，分別為 1.26 μg/mL 和 1.17 μg/mL，咖啡酸的含量不足 0.5 μg/mL。

果汁釀制成梨酒后，總酚含量都有不同程度下降。其中WFW和FW分別較果汁下降了20.4%和21.3%，PFW較果汁下降了27.6%，說明發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)總量有所損失，以PFW下降幅度最大。WFW的總酚含量最高，F(xiàn)W次之，而PFW的總酚含量最低見表2。

在WFW和PFW中所含的酚類中，熊果苷的含量均最高，分別是 51.04 μg/mL 和 38.26 μg/mL，兒茶素和3，4-二羥基苯丙氨酸含量在WFW中分別排第二和第三，而在PFW中則分別位列第三和第二。在FW中，兒茶素含量最高，熊果苷次之，3，4-二羥基苯丙氨酸含量排第三。在3種梨酒中，其余酚類物質(zhì)含量均較少，不足 5 μg/mL，咖啡酸含量甚至不足 0.5 μg/mL。

表2 不同部位“雪花”梨榨取果汁所釀梨酒的酚類物質(zhì)比較Table 2 Comparison of phenolics in different wine brewed by juice from differetn parts of'Xuehua'Pear

梨汁釀造成梨酒后，各單體酚的含量發(fā)生了變化。熊果苷、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸和蘆丁含量在不同梨酒中均呈不同程度的下降趨勢，其中綠原酸減少幅度最大，為83.5%～98.3%；蘆丁次之，減少77%～80%，原兒茶酸減少50%～70%，熊果苷和沒食子酸減少幅度相近，為13%～43%。而3，4-二羥基苯丙氨酸、兒茶素含量則顯著增加，分別是梨汁的2.60倍（PFW）、5.28倍（FW）和7.16倍（WFW）。槲皮素含量在WFW和PFW中小幅增加了1%左右，在FW中增加18.0%。表兒茶素含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，PFW和FW分別是對應(yīng)果汁的3.43倍和2.77倍，而在WFW中則略有減少（表2）。

2.2 梨酒的抗氧化性能分析

采用對DPPH自由基清除法測定比較了3種梨酒的抗氧化性能見圖1。

DPPH自由基清除率與酚類物質(zhì)含量變化趨勢一致，WFW的DPPH自由基清除率最高，F(xiàn)W次之，PFW的清除率最低。通過相關(guān)分析得知，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.746（p＜0.05）。通過對3種主要酚類物質(zhì)含量和DPPH自由基清除率之間做相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為0.678（p＜0.05），可知含量較低的其他酚類物質(zhì)對清除DPPH自由基同樣發(fā)揮著作用。

圖1 “雪花”梨不同部位所釀梨酒對DPPH自由基清除能力比較Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging ability by different pear wine brewed using different part of'Xuehua'pear

對DPPH自由基清除率和各種單體酚含量進行偏最小二乘分析得知，任何一種酚類物質(zhì)對DPPH自由基清除率均沒有顯著影響。說明清除DPPH自由基是各種酚類物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。

3 討論和結(jié)論

WFJ酚類含量高于PFJ（表1），其含量的差異主要來源于果心，果心是酚類物質(zhì)的重要來源[14]。而FJ酚類特別是綠原酸含量高于PFJ，與已有的文獻報道果肉的酚含量較低不同[14，19]，可能與提取方法有關(guān)。文獻報道是基于分析為目的的，多采用乙醇或甲醇提取，而本研究的材料是鮮榨果汁，沒有添加任何溶劑。鞠志國等[20]報道酚類物質(zhì)存在于液泡中，因此果肉中的酚類物質(zhì)相對于果皮、果心可能更容易隨果汁的榨取而溶出，而果皮、果心中的酚類物質(zhì)不能在此方法中有效溶出所致。

熊果苷、綠原酸和蘆丁是梨的主要酚類物質(zhì)，并且主要存在于果皮和果心中，在果肉中含量較低，與李麗梅等[14]在“雪花”梨的研究結(jié)果一致。所以WFJ和PFJ中熊果苷含量高于FJ（表1）。同時由于果肉中綠原酸含量相對熊果苷更高，故FJ中綠原酸含量高于WFJ和PFJ。在本研究中兒茶素的含量較低，可能與提取方法有關(guān)。

果汁釀制成梨酒后，酚類物質(zhì)含量下降，與蘋果酒發(fā)酵過程中多酚含量的變化規(guī)律一致。多酚含量下降的原因是酵母菌細胞壁的吸附和多酚與細胞壁蛋白質(zhì)的反應(yīng)所致，同時在發(fā)酵過程中多酚物質(zhì)也有部分的氧化[21]。

葡萄酒中含量較高的單體酚是兒茶素和沒食子酸，含量15 mg/L～30 mg/L[22]，而梨果實特別是梨皮和梨果心中則富含熊果苷和綠原酸、蘆丁，但綠原酸、蘆丁不穩(wěn)定[23-24]，在發(fā)酵過程中可能被氧化或降解了，故梨酒中主要單體酚為熊果苷和發(fā)酵過程中可能由酵母代謝所產(chǎn)生的3，4-二羥基苯丙氨酸和兒茶素?？梢姽频姆宇愇镔|(zhì)差異來源于原料和酵母代謝。熊果苷具有平喘、祛痰的作用[25]，或許賦予梨酒更多的生理功能，還有待于開展動物實驗進行驗證。在發(fā)酵過程中，單體酚含量發(fā)生復(fù)雜變化，有可能涉及到相互轉(zhuǎn)化，關(guān)于酚類物質(zhì)變化的原因以及相互轉(zhuǎn)換機理還有待于進一步的研究。

已有的文獻報道清除DPPH自由基與總酚含量呈顯著正相關(guān)[26-28]，在本研究中兩者的相關(guān)系數(shù)為0.746（p＜0.05）。但偏最小二乘分析結(jié)果顯示，單個酚均對清除DPPH自由基無顯著影響，推測清除DPPH自由基是各種酚類物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。具體的機理還需要進行深入的研究。

通過本研究得出結(jié)論：

1）果汁釀制成梨酒后，總酚含量下降。其中熊果苷、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸和蘆丁含量在不同梨酒中均呈下降趨勢，其中綠原酸減少幅度最大；3，4-二羥基苯丙氨酸、兒茶素含量則顯著增加；槲皮素增幅較小，而表兒茶素含量則在3種梨酒中呈現(xiàn)不同的變化趨勢。

2）熊果苷、兒茶素和3，4-二羥基苯丙氨酸是3種梨酒中含量最高的3種酚，其余酚類物質(zhì)含量均較少，不足5 μg/mL，咖啡酸含量甚至不足0.5 μg/mL。

3）DPPH自由基清除率與酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)，但偏最小二乘分析結(jié)果顯示，任何一種酚類物質(zhì)對DPPH自由基清除率均沒有顯著影響。說明清除DPPH自由基是各種酚類物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。