劉翠翠，郭東龍，王景雪

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是臨床常用的腫瘤化療藥物，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，可以抑制人體的體液免疫和細(xì)胞免疫，造成機體免疫功能的下降，不利于腫瘤病人的醫(yī)治和術(shù)后恢復(fù)。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是我國傳統(tǒng)的名貴藥用植物，被列為“九大仙草”之首，素有“藥中黃金”之稱，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，鐵皮石斛具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效，被錄入2010版藥典[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，鐵皮石斛富含石斛多糖，有抗疲勞、抗氧化、抗衰老增強機體免疫力抗腫瘤等藥理作用，鐵皮石斛體外能促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，增加單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK細(xì)胞）活性，明顯增強小鼠免疫功能。許多研究證明，植物多糖可以參與機體多種生理代謝過程，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制腫瘤、抗衰老、抗氧化等多種生物活性[2-3]。宋燕華等[4]研究了鐵皮石斛葉對二代繁殖雌性大鼠免疫水平的影響。發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉能提高動物NK細(xì)胞活性，增強細(xì)胞免疫功能。程東等的實驗也有類似結(jié)果[5]。宋美芳等研究了齒瓣石斛多糖和鐵皮石斛多糖對小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)兩者均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞中γ－干擾素和白細(xì)胞介素－2的分泌、增加小鼠足跖腫脹度和脾臟指數(shù)[6]。李光等研究了4種不同種屬的石斛多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，其中鐵皮石斛多糖和齒瓣石斛多糖效果較好[7]。眾多研究表明石斛確有提高免疫功能的作用。斛芪提取物選用鐵皮石斛、黃芪等名貴中藥材，設(shè)計最優(yōu)比例混合制成復(fù)方粉。其中黃芪也是一味名貴中藥，黃芪中含有黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮類化合物等68種有效化學(xué)成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)黃芪具有增強機體免疫功能的作用[8]。趙曉峰等[9]研究顯示黃芪對免疫功能低下的小鼠體液免疫功能和巨噬細(xì)胞吞噬功能具有增強作用。楊偉等[10]研究顯示黃芪多糖對免疫缺損小鼠的胸腺細(xì)胞具有保護(hù)作用，可降低其受損后的凋亡，從而改善胸腺功能，提高免疫力。本研究旨在研究以鐵皮石斛、黃芪、百合等七味中藥組成的斛芪提取物對小鼠免疫功能的影響，為進(jìn)一步開發(fā)針對化療病人術(shù)后恢復(fù)、提高免疫力的輔助性功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

純系ICR雄性老鼠：體質(zhì)量18 g～22 g，購于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2015—0001，使用許可證號：SYXK（晉）2015—0001。所有實驗動物均飼養(yǎng)于（25±2）℃的恒溫恒濕室內(nèi)。

1.1.2 藥品與試劑

斛芪提取物：由生命科學(xué)學(xué)院實驗室制備，按照現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)優(yōu)化比例將鐵皮石斛與黃芪、百合等中藥材制成復(fù)合粉。稱取50 g斛芪復(fù)合粉溶于1 000 mL蒸餾水中，攪拌均勻，置于40℃水浴超聲提取30 min，取上清液，6 000 r/min離心5 min，取上清液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，溫度控制在60℃，濃縮至100 mL，所得斛芪提取物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

環(huán)磷酰胺：西亞試劑公司；印度墨水：北京博奧拓達(dá)有限公司；0.1%Na2CO3；Hematoxylin-Eosin/HE 試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time） 試劑盒、RNAiso Plus：TaKaRa；異丙醇、氯仿：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DK-8D恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FA224電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌：上海博訊實業(yè)有限公司；TU1810紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3K15型高速離心機：德國Sigma；9600Real-time PCR反應(yīng)系統(tǒng)、LineGene9600 Plus熒光定量PCR儀：杭州博日科技有限公司；ACS-計價電子秤：武義大河電子有限公司；OLYMPUS BX53正置熒光顯微鏡：上海普赫光電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建模與分組方式

取清潔級ICR小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。1周后按體重隨機分成5組，每組12只，分為模型組、正常對照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組。

建模方式為除了正常對照組外，全部小鼠連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，構(gòu)建免疫抑制小鼠模型[11-13]。

建模成功后，各組每天按照高劑量組2 000 mg/kg；中劑量組1 000 mg/kg；低劑量組500 mg/kg的劑量灌胃，從建模后的第1天起，各實驗組按照設(shè)計的劑量灌胃，連續(xù)灌胃30 d，同期正常對照組和模型組分別灌胃0.2 mL/d生理鹽水。

1.3.2 單核-巨噬細(xì)胞功能測定——小鼠碳粒廓清實驗

給藥30 d后，按10 mL/kg計算，于尾部靜脈注射稀釋后的印度墨汁，待墨汁注入，立即計時。于2、10 min眼眥靜脈叢取血，立即溶于0.1%Na2CO3溶液中吸打混勻，使用紫外可見分光光度計在600 nm波長下測定吸光值。隔天頸椎脫臼處死后，解剖小鼠，取肝臟和脾臟并稱重，計算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α[14-15]。稱重后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

式中：A2為2 min溶液吸光值；A10為10 min溶液吸光值；t2為計時10 min；t1為計時 2 min。

式中：K為廓清指數(shù)[16]。

1.3.3 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)測定

小鼠處死后，取胸腺及脾臟，稱重，計算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)/%= 胸腺質(zhì)量（mg）/體重（g）×100脾臟指數(shù)/%= 脾臟質(zhì)量（mg）/體重（g）×100 1.3.4 胸腺、脾臟組織切片制作及染色

將稱重后的胸腺、脾臟各剪取1 cm3迅速投于4%的多聚甲醛中固定后制作石蠟切片，制作過程如下：取材→固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→粘片與烤片→脫蠟與醇化→染色→脫水、透明與封片，以便蘇木素—伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。常規(guī)染色步驟：（1）二甲苯（Ⅰ）15 min；（2）二甲苯（Ⅱ）15 min；（3）二甲苯：無水乙醇=1∶1（體積比），2 min；（4）100%乙醇（Ⅰ）5min；（5）100%乙醇（Ⅱ）5 min；（6）80%乙醇 5min；（7）蒸餾水 5 min；（8）蘇木精液染色5 min；（9）水洗 10 min 或流水沖洗 5 min；（10）1%鹽酸乙醇 30 s；（11）水洗 30 s；（12）蒸餾水過洗 5 s；（13）0.5%伊紅液染色1 min～3 min；（14）蒸餾水稍洗 30 s；（15）80%乙醇稍洗 30 s；（16）95%乙醇（Ⅰ）1 min；（17）95%乙醇（Ⅰ）1 min；（18）無水乙醇（Ⅰ）3 min；（19）無水乙醇（Ⅱ）3 min；（20）二甲苯（Ⅰ）3 min；（21）二甲苯（Ⅱ）3 min；（22）中性樹膠封固，進(jìn)行HE染色觀察[17]。

1.3.5 反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantification PCR，QRT-PCR）驗證小鼠免疫相關(guān)基因

取小鼠肝臟脾臟用Trizol法提取腸組織RNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測并測定其波長260 nm和280 nm處的光密度值，計算OD260nm/OD280nm比值，分析純度。

在GenBank中查找出各基因的序列，使用Primer 5.0軟件對各差異表達(dá)基因進(jìn)行跨內(nèi)含子設(shè)計引物，見表1，實驗利用GAPDH作為內(nèi)參基因，消除本底模板差異。

表1 待測基因QRT-PCR引物的堿基序列、解鏈溫度值Table 1 Base sequences and Tm of specific oligonucleotide primers for QRT-PCR

反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR使用9600Real-time PCR反應(yīng)系統(tǒng)，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒?？偡磻?yīng)體系為 20 μL，包括 10 μL SYBR GreenⅠ，3.4 μL 去 RNA 酶水，各 0.8 μL 的引物，5 μL cDNA模板。qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 10 min，隨后 95℃變性 10 s，55℃退火 15 s，60℃延伸10 s，72℃終延伸20 s，50個循環(huán)。各反應(yīng)重復(fù)3次。熒光定量PCR數(shù)據(jù)的分析采用2-△△CT法[18]。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 斛芪提取物對小鼠體重的影響

按照1.3.1的方法灌胃小鼠30 d后，統(tǒng)計小鼠體質(zhì)量，結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠灌胃30 d后平均體質(zhì)量Fig.1 Average body mass after 30 days of intragastric administration in each group of ICR mice

由圖1可見，模型組及高、中、低劑量組小鼠體質(zhì)量明顯低于正常對照組，中、低劑量組略高于模型組，說明斛芪提取物對由于免疫低下造成的小鼠體質(zhì)量減少有一定的緩解作用，且與劑量有關(guān)。

2.2 斛芪提取物對小鼠碳粒廓清能力的影響

按1.3.2的方法，測定了模型組、正常對照組和不同劑量組的碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 斛芪提取物對小鼠碳粒廓清能力的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of Huqi extractive on carbon particle clearance ability of mice（±s，n=8）

表2 斛芪提取物對小鼠碳粒廓清能力的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of Huqi extractive on carbon particle clearance ability of mice（±s，n=8）

注：與正常組相比：*p＜0.05，差異顯著，**p ＜0.01，差異極顯著；與模型組相比：##p＜0.01，差異極顯著；-表示正常對照組和模型組分別灌胃0.2 mL/d生理鹽水。

組別劑量/（mg/kg）廓清指數(shù)吞噬指數(shù)模型組 - 0.004 5±0.00 35** 2.318 3±0.780 9**高劑量組 2 000 0.026 1±0.013 9## 5.206 9±1.666 2##中劑量組 1 000 0.016 3±0.00 79* 4.568 5±0.704 9##低劑量組 500 0.012 3±0.010 6** 3.539 7±0.564 4**正常對照組 - 0.029 2±0.015 3## 5.752 2±1.537 5##

模型組的廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)均顯著小于正常對照組（p＜0.01），與模型組相比，3個實驗組的廓清指數(shù)均高于模型組。且模型組與高劑量組有極顯著性差異（p＜0.01）。從吞噬指數(shù)來看，與模型組相比，3個實驗組吞噬指數(shù)顯著增高，且高、中劑量組具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），說明斛芪提取物具有增強小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清功能的作用。

2.3 斛芪提取物對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

斛芪提取物飼喂免疫低下小鼠30 d后，分別稱取各組小鼠的胸腺和脾臟以及體質(zhì)量，計算出臟器指數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 斛芪提取物對小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of Huqi extractive on thymus and spleen index in mice（±s，n=8）

表3 斛芪提取物對小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of Huqi extractive on thymus and spleen index in mice（±s，n=8）

注：與正常組相比：**p＜0.01，差異極顯著；與模型組相比：#p＜0.05，差異顯著，##p＜0.01，差異極顯著；-表示正常對照組和模型組分別灌胃0.2 mL/d生理鹽水。

組別劑量/（mg/kg）胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)模型組 - 1.664 3±0.828 8 4.326 8±1.467 0高劑量組 2 000 2.870 1±0.6146**## 6.896 6±1.0468**##中劑量組 1 000 2.613 9±0.696 7**## 5.555 1±0.854 3#低劑量組 500 2.466 9±0.746 9**# 5.249 2±1.319 7正常對照組 - 1.755 6±0.352 3 5.064 8±1.180 8

模型組胸腺指數(shù)低于正常對照組，3個實驗組與正常對照組相比差異都具有極顯著性（p＜0.01），與模型組相比高、中劑量組差異具有極顯著性（p＜0.01），低劑量組有顯著性差異（p＜0.05）。模型組的脾臟指數(shù)低于正常對照組，說明環(huán)磷酰胺能使小鼠免疫功能受到抑制，免疫抑制模型構(gòu)建成功。其中高劑量組與模型組和正常對照組相比都具有極顯著性（p＜0.01），表明斛芪提取物具有促進(jìn)小鼠免疫器官發(fā)育的作用，有助于提高小鼠的免疫力。

2.4 斛芪提取物對小鼠免疫器官的影響

2.4.1 胸腺觀察

各組小鼠胸腺病理觀察圖見圖2。

模型組小鼠胸腺皮質(zhì)薄于正常對照組，淋巴細(xì)胞大量減少。高、中劑量組小鼠胸腺胸小葉分明，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞密集，著色深。網(wǎng)狀細(xì)胞清晰，胸腺組織與正常對照組接近。說明斛芪提取物可以增加淋巴細(xì)胞的發(fā)育。低劑量組小鼠胸腺淋巴細(xì)胞分布較稀疏，與模型組相近。說明斛芪提取物對由于免疫低下造成的胸腺淋巴細(xì)胞減少有修復(fù)作用，且有劑量效應(yīng)。說明斛芪提取物對環(huán)磷酰胺致免疫低下的小鼠胸腺損傷有修復(fù)作用。

圖2 各組小鼠胸腺病理觀察圖（HE×10）Fig.2 Pathological observation of thymus in each group of mice（HE × 10）

2.4.2 脾臟觀察

各組小鼠脾臟病理觀察圖見圖3。

圖3 各組小鼠脾臟病理觀察圖（HE×10）Fig.3 Pathological observation of spleen in each group of mice（HE × 10）

模型組小鼠脾組織顯著小于正常對照組。高劑量組小鼠脾組織中央動脈周圍淋巴細(xì)胞分布密集，著色深，單核細(xì)胞存在，脾索、血竇分明；中劑量組小鼠脾組織紅髓區(qū)變窄；低劑量組小鼠脾組織中央動脈周圍淋巴細(xì)胞分散；各組小鼠脾組織未發(fā)現(xiàn)有明顯損傷[19]，說明斛芪提取物對環(huán)磷酰胺致免疫低下的小鼠脾臟發(fā)育有促進(jìn)作用，從而提高小鼠免疫力。

綜上所述，斛芪提取物對CTX處理的小鼠的體重有改善作用以及肝損傷有修復(fù)效果，同時對小鼠非特異性免疫功能有調(diào)節(jié)作用，且有劑量效應(yīng)。

2.5 與免疫相關(guān)基因CCL2的表達(dá)量

其中高劑量組CCL2基因相比正常組呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，當(dāng)與模型組相比較時，高、中、低劑量組基因量均上調(diào)，且差異顯著（p＜0.05）。

圖4 CCL2基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of CCL2 gene

3 結(jié)論與討論

免疫器官包括中樞免疫器官和外周免疫器官，小鼠中最重要的免疫器官為胸腺、脾臟。免疫器官的發(fā)育狀況會直接影響到機體的免疫力[20]。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是高等動物和人的非特異性免疫系統(tǒng)之一，其功能主要表現(xiàn)為對顆粒性物質(zhì)如外來的病毒、細(xì)菌等病原體進(jìn)行吞噬、消化和清除，并分泌各種細(xì)胞因子。碳粒廓清實驗就是利用單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬、清除碳粒（顆粒性物質(zhì)）以檢測該系統(tǒng)對顆粒性物質(zhì)的吞噬、清除功能[7]。

趨化因子是一類能夠趨化細(xì)胞的遷移的小分子分泌蛋白，細(xì)胞沿著趨化因子濃度增加的信號向趨化因子源處的遷徙，有些趨化因子在免疫監(jiān)視過程中控制免疫細(xì)胞趨化。CCL2是趨化因子CC亞家族中的一員，能夠趨化和激活T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，使免疫細(xì)胞向病變部位聚集[21]，從而起到免疫調(diào)控作用。也有報道稱，CCL2可以通過抑制單核細(xì)胞，同時刺激IL-4的分泌，進(jìn)而抑制腫瘤免疫[22]。有研究表明IL-18和CCL2 mRNA水平的提高都會伴隨著蛋白表達(dá)的提高，而且這些基因的表達(dá)也可以直接表明對DCs等免疫細(xì)胞具有影響。因此可以根據(jù)mRNA水平的變化間接反映蛋白水平的變化以及胞外多糖對相關(guān)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[23-24]。

本實驗從非特異性免疫功能角度研究了斛芪提取物對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的影響。結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下在灌胃30 d斛芪提取物后得到了矯正。與模型組相比，高、中劑量組吞噬指數(shù)明顯增加，免疫器官指數(shù)也有提高，各項測定結(jié)果與模型組相比，均具有顯著性差異，說明斛芪提取物對小鼠免疫功能有明顯的增強功效，且具有劑量效應(yīng)。從碳粒廓清能力和免疫器官切片以及免疫相關(guān)基因表達(dá)等方面研究斛芪提取物對小鼠免疫功能的影響，表明斛芪提取物可以明顯提高小鼠免疫力。