袁燕，崔雪惠，張立夏，董艷芬，梁燕玲，班俊峰，謝青春，申樓，呂竹芬，陳燕忠，*

（1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州510006；3.廣東省藥物緩控釋制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；4.廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，新藥研發(fā)中心，廣東廣州510006）

根據(jù)2018年的《中國家庭健康大數(shù)據(jù)報告》顯示，我國慢性病患者近3億，占總死亡人數(shù)的86.6%，氧化應(yīng)激是各種慢性疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。在諸多誘發(fā)慢性疾病的因素中，氧化應(yīng)激參與多個生理[1]、病理過程[2]，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，如血管疾病、糖尿病、癌癥等[3]，所以臨床上將控制氧化應(yīng)激作為治療慢性病的關(guān)鍵。近期研究表明，天然的抗氧化劑具有良好的抗氧化效果，如姜黃素可降低炎癥因子的分泌[4]，葛根素可抑制過量氧自由基[5]等，所以從植物中提取天然抗氧化劑是研究的新趨勢。

烏欖葉，系橄欖科橄欖屬，其在中國華南地區(qū)有著豐富的產(chǎn)量，在傳統(tǒng)中藥中常被用于治療感冒[6]、上呼吸道炎、肺炎[7]等，具有潛在的抗氧化應(yīng)激作用。近年對烏欖葉的生理活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)烏欖葉水提取物對血管平滑肌具有明顯的舒張作用[8]，可產(chǎn)生快速持久的降壓及減慢心率的作用[9]；烏欖葉乙醇水提取物可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗氧化活性[10-11]，起到清除氧自由基[12]、抗衰老的作用[13]，但是對藥效和機(jī)制未進(jìn)行深入研究。

在體外實驗中，羥自由基是最活潑的自由基也被認(rèn)為是衰老的主要誘因，而且1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS+]自由基清除法已被廣泛應(yīng)用于天然中藥材抗氧化能力的測定[14-15]；在氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法中抗氧化劑可抑制由自由基引起熒光變化，是經(jīng)典考察氧化情況的方法[16]。在體內(nèi)試驗中，機(jī)體氧化應(yīng)激與防御系統(tǒng)的總抗氧化能力（total antioxidant capacity assay kit，T-AOC） 密切相關(guān)，而且它是評估抗氧化能力的重要指標(biāo)[17]?；钚匝踝杂苫漠a(chǎn)生會形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA），所以其含量增加是衰老的標(biāo)志[18]。而且超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，而谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）將過氧化氫分解成其他化合物，均是體內(nèi)酶防御系統(tǒng)中較重要的酶[19]。

本研究采用體內(nèi)外的抗氧化研究，推測其參與的途徑，為開發(fā)其藥用價值和其在抗氧化應(yīng)激方面的深入研究提供前期依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 烏欖葉

烏欖（Canarium pimela K.D.Koenig）的葉子于2015年8月中旬在中國廣東省中山市的草藥園收集，該植物由劉基柱教授分類鑒定為錦葵科植物百合科，并在廣東藥科大學(xué)中藥標(biāo)本館保藏了憑證標(biāo)本（編號20150825）。

1.1.2 試劑與儀器

蘆?。ㄅ?00080-201409）：中國食品藥品檢定研究院；維生素 C（Vitamin C，VC，批號 SLBN3833V）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽[2，2′-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH，批號WXBC383TV]、熒光素（fluorescein，F(xiàn)L，批號 BCBT0195）、水溶性維生素 E（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox，批號 BSBC9713V）和 D-半乳糖：Sigma 試劑有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT，批號 34515）、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批號 F1719012）：阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號C10088334）：上海麥克林生化有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；其它試劑均為分析純。

UV-2700型紫外-可見分光光度計：日本島津公司；LB940多功能酶標(biāo)儀：美國BioTek公司。

1.1.3 實驗動物

SPF級ICR小鼠60只，雄性，購于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，生產(chǎn)許可證號：SCK（蘇）2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境12 h黑暗的光照周期，溫度在18℃～21℃和濕度在45%～65%，給予喂食認(rèn)證的飲食和純凈水。

1.2 方法

1.2.1 烏欖葉黃酮的提取與純化

稱取烏欖葉粉末加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，料液比 1∶50（g/mL），提取 60 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到烏欖葉提取液后用大孔吸附樹脂（AB-8，1BV=500mL）處理，加入提取液后依次用水（2 BV）、30%乙醇（2 BV）、50%乙醇（3 BV）、95%乙醇（2 BV）洗脫，流速為1滴每秒，合并不同洗脫部位后減壓濃縮，冷凍干燥，待用。

1.2.2 烏欖葉中黃酮化合物含量的測定

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品40 mg加入一定量的50%乙醇，配置成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。準(zhǔn)確移取 0.0、0.8、0.32、1.6、2.0、2.4、3.2 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，先分別加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.4 mL，混勻后靜置6 min，最后加入1 mol/L NaOH溶液4.0 mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以50%乙醇溶液為空白參比溶液。按照紫外-可見分光光度法，在500 nm處測定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度C為橫坐標(biāo)（X），吸光度A為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程。取2 mL烏欖葉黃酮溶液置于10 mL容量瓶中，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的過程，測定吸光度，按照回歸方程計算出烏欖葉黃酮溶液中總黃酮（total flavonoids from Canarium pimela leave，TFCPL）的含量，結(jié)果以每克樣品所含蘆丁當(dāng)量的毫克數(shù)來表示[mg rutin equivalent（RE）/g]。

1.2.3 烏欖葉黃酮清除自由基能力測定

1.2.3.1 對DPPH自由基清除能力

參考Bumbudsanpharoke N等[14]報道的方法來評價烏欖葉黃酮對DPPH自由基的清除活性。分別取烏欖葉黃酮（5 μg/mL～50 μg/mL）溶液與 DPPH 溶液（0.1 mmol/L）各 2 mL混合，VC和 BHT溶液（5 μg/mL～50 μg/mL）為陽性對照，避光靜置 30 min，在 517 nm 測定，計算公式如下：

式中：A1為空白組吸光度值；A2為待測樣品吸光度值；A3為待測樣品本身吸光度值。

1.2.3.2 對ABTS+自由基清除率

精密量取烏欖葉黃酮溶液（0.05 mg/mL～0.7 mg/mL）40 μL 后加入 ABTS+·溶液 4 mL，渦旋 30 s，避光 10 min后在734 nm處測定吸光度A1。ABTS+·溶液作空白，吸光度為 A2[15]；ABTS+·的稀釋：取 ABTS+·工作液，用磷酸鹽緩沖液溶液稀釋，要求在常溫下734 nm處吸光值為0.7±0.02，對 ABTS+·的清除率按照下式計算：

式中：A2為空白吸光度值；A1為待測樣品吸光度值。

1.2.3.3 對羥自由基清除率

基于脫氧核糖降解測定法[20]，吸取烏欖葉黃酮溶液（0.05 mg/mL～0.5 mg/mL）200 μL，依次加入磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH7.4）600μL，脫氧核糖（50 mmol/L）100 μL、Na2EDTA（1 mmol/L）100 μL、FeCl3（3.2 mmol/L）100 μL、H2O2（50 mmol/L）100 μL、VC（1.8 mmol/L）100 μL，定容至1600μL，50℃溫育20min，加入三氯乙酸（10%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）500 μL，5%的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）300 μL，在105℃加熱15 min顯色。冷卻后，在530 nm處測定。

式中：A0為空白吸光度值；A1為待測樣品吸光度值。

1.2.4 還原能力測定

精密量取烏欖葉黃酮溶液（0.025mg/mL～0.16mg/mL）0.5 mL與磷酸鹽緩沖液（pH=6.6，0.2 mol/L）2.5 mL，鐵氰化鉀（1%）2.5 mL，混合，50℃保溫 20 min后，加入三氯乙酸（10%）2.5 mL，3 000 r/min離心 10 min，取上清液2.5 mL加入蒸餾水2.5 mL和氯化鐵溶液（0.1%）0.5 mL，放置10 min，于700 nm測定吸光度。吸光度越大還原能力越強(qiáng)[21]。

1.2.5 抗脂質(zhì)氧化能力測定

參照文獻(xiàn)[22]，精密量取肝勻漿（1%）2 mL，分別加入烏欖葉黃酮溶液（0.05 mg/mL～1.0 mg/mL）0.4 mL，依次加入FeSO4（6mmol/L）和H2O2（60mmol/L）各200μL，于37℃孵育1 h后，加入三氯乙酸（15%，g/mL）2 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，加入0.67%的硫代巴比妥酸2 mL，沸水浴顯色15 min，冷卻，在532 nm測定。由以下公式計算抑制率：

式中：A0為空白對照的吸光度值；A1為待測樣品的吸光度值。

1.2.6 烏欖葉黃酮總抗氧化能力測定

在 96孔板中加入 Trolox溶液 25 μL，F(xiàn)L（8.16×10-5mmol/L） 溶液 150 μL，振搖 2 min，37 ℃下孵育10 min后加入 AAPH（153 mmol/L）溶液 25 μL 啟動反應(yīng)，以激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm測定，2 min測定一次，共循環(huán)45次[16]。以時間為橫坐標(biāo)，凈面積為縱坐標(biāo)，繪制Trolox系列標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取烏欖葉黃酮溶液25 μL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的方法，測定熒光強(qiáng)度，按照回歸方程計算出樣品的濃度，通過烏欖葉黃酮與Trolox的netAUC的比值與二者克分子濃度的比值做比，得到樣品的ORAC值，即Trolox當(dāng)量（TE），ORAC值以μmol TE/g表示。

式中：fn為第n個測定點的相對熒光強(qiáng)度；AUC為待測樣品的AUC；AUCAAPH+為僅有AAPH作用下的AUC。

1.2.7 烏欖葉黃酮對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠影響

1.2.7.1 分組及給藥

將ICR小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組（每組10只）：空白組、D-半乳糖氧化損傷模型組、烏欖葉黃酮高劑量組（9.2 g/kg）、中劑量組（6.2 g/kg）、低劑量組（3.2 g/kg）、陽性組（VC，100 mg/kg）。 灌胃給藥，1次/d，給藥容積0.1 mL/10 g；空白組和模型組給予等量的生理鹽水；除空白組外其他組每天均腹腔注射半乳糖1 000 mg/kg，空白組用生理鹽水代替。根據(jù)體重變化調(diào)整小鼠腹腔注射和灌胃劑量，連續(xù)45 d[23]。每天稱重并記錄，觀察小鼠的體征、外觀等。

1.2.7.2 對臟器指數(shù)的影響

末次灌胃后禁食不禁水24 h，摘取眼球取血后立即頸椎脫臼處死，迅速取腎臟、肝臟和胰腺并稱重，計算臟器指數(shù)，計算公式為：

1.2.7.3 血液中抗氧化指標(biāo)測定

按試劑盒要求制備血清，并測定T-AOC、GSHPx、SOD活性和MDA含量，每個樣品一式3份。各項指標(biāo)的具體測定原理、試劑的配制方法，和蛋白含量的測定方法以及計算方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7.4 組織病理學(xué)

將肝臟和腎臟組織放在4%多聚甲醛（pH=7.4）中固定24 h，在不同濃度蔗糖的100 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）中于4℃溫育過夜使組織脫水后包埋在石蠟中，連續(xù)切片（7 mm）安裝在硅烷包被的載玻片上并用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。使用LEICA DMI8倒置顯微鏡下觀察肝臟的組織病理學(xué)變化并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)蘆丁的濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1），得到回歸方程為：Y=12.892 7X-1.443 8-4，（R2=0.999）；測定烏欖葉黃酮溶液中的吸光度值，根據(jù)回歸方程得到烏欖葉黃酮中所含蘆丁當(dāng)量為（336.4±2.56）mg RE/g。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standrad curve of rutin

2.2 自由基清除試驗

2.2.1 DPPH自由基清除力

烏欖葉黃酮清除DPPH自由基能力圖見圖2。

由圖2可知，烏欖葉黃酮對DPPH·清除能力呈明顯的濃度依賴性，當(dāng)濃度大于12 μg/mL時，清除率增長緩慢且逐漸接近于BHT的清除能力。當(dāng)濃度達(dá)到50 μg/mL時，烏欖葉黃酮[（74.59±0.25）%]和BHT[（73.65±0.43）%]清除率相當(dāng)，均低于VC[（92.51±0.54）%]。結(jié)果表明烏欖葉可以通過與DPPH·單電子的配對能力和供氫能力產(chǎn)生抗氧化作用。Wu J等[12]研究表明烏欖葉具有良好的DPPH·清除能力與本試驗結(jié)果一致。

圖2 烏欖葉黃酮清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH free radical scavenging activity of TFCPL

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

烏欖葉黃酮化合物清除ABTS+自由基能力圖見圖3。

圖3 烏欖葉黃酮化合物清除ABTS+自由基能力Fig.3 ABTS+free radical scavenging activity of TFCPL

如圖3，在0.3 mg/mL之前隨著烏欖葉黃酮濃度的升高，對ABTS+·的清除能力逐漸增強(qiáng)，之后增長緩慢。烏欖葉黃酮的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50=0.158mg/mL）與 BHT（IC50=0.148mg/mL）相當(dāng)而且小于VC（IC50=0.186 mg/mL），具有較強(qiáng)的清除能力。其中ABTS+·是過氧化物酶的底物，烏欖葉中可能含有與VC和BHT等量的陰離子可以與ABTS+·中陽離子結(jié)合，表明烏欖葉黃酮可能是通過有效成分中陰離子結(jié)合方式產(chǎn)生抗氧化作用。

2.2.3 羥自由基清除能力

烏欖葉黃酮化合物羥自由基清除能力見圖4。

圖4 烏欖葉黃酮化合物羥自由基清除能力Fig.4 The scavenging capacities for OH free radicals of TFCPL

由圖4可知，烏欖葉黃酮濃度與羥自由基的清除力呈濃度依賴性，在0.5 mg/mL時已達(dá)到較高清除率，VC對于OH·清除率的IC50為0.168 mg/mL，烏欖葉黃酮為0.054 mg/mL，表明其對OH·清除率高于VC。烏欖葉黃酮清除活性主要由于Fe2+和Cu2+等抑制羥自由基的產(chǎn)生[24]，結(jié)果表明其可能通過產(chǎn)生螯合離子來產(chǎn)生抗衰老的作用。烏欖葉黃酮清除能力強(qiáng)于VC可能由于含有多種有效成分，之間發(fā)生相互作用后產(chǎn)生加強(qiáng)抗羥自由基的作用。

2.3 還原能力

烏欖葉黃酮的總還原能力圖見圖5。

圖5 烏欖葉黃酮的總還原能力Fig.5 The reducing power of TFCPL

由圖5可知，當(dāng)烏欖葉黃酮溶液濃度為0.025mg/mL～0.15 mg/mL 時，還原能力依次為：VC＞TFCPL＞BHT。該反應(yīng)是基于烏欖葉黃酮在三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）存在情況下將Fe3+還原為Fe2+的能力，形成強(qiáng)藍(lán)色Fe2+-TPTZ絡(luò)合物，抗氧化防御系統(tǒng)增強(qiáng)；結(jié)果表明烏欖葉的還原電位可能與它們破壞自由基鏈反應(yīng)的電子供體能力有關(guān)。

2.4 抗脂質(zhì)過氧化能力

烏欖葉黃酮抗脂質(zhì)過氧化能力圖見圖6。

圖6 烏欖葉黃酮抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.6 The activity of anti-lipid peroxidation of TFCPL

脂質(zhì)過氧化是細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸的氧化的過程，已報道抗氧化劑的抑制作用可能是由于在反應(yīng)體系中對FeCl2-H2O2產(chǎn)生的清除能力，從而影響自由基反應(yīng)鏈。由圖6可知，在濃度為1.0 mg/mL時TFCPL抑制率達(dá)到（91.31±0.11）%，而且其脂質(zhì)過氧化清除能力（IC50=0.065mg/mL）與維生素C（IC50=0.058 mg/mL）相當(dāng)，表明烏欖葉黃酮具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)氧化能力，可能是通過對金屬離子的螯合活性產(chǎn)生抗氧化作用，對其金屬離子螯合方面提供初步依據(jù)。

2.5 總抗氧化能力

VC和TFCPL熒光衰減圖見圖7。

圖7 VC和TFCPL的熒光衰減圖Fig.7 Fluorescence attenuation map of a VCand TFCPL

通過Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得其ORAC值后逐一比較，觀察其抗氧化能力，結(jié)果見圖7A和圖7B所示，VC和烏欖葉黃酮能夠明顯抑制活性氧自由基對熒光物質(zhì)的淬滅速率。其中VC在反應(yīng)初期抑制活性比較強(qiáng)但是后期對熒光物質(zhì)的淬滅速度急劇下降，但是烏欖葉黃酮的抑制強(qiáng)度呈逐漸減少的狀態(tài)，其前期的抑制力雖然低于VC，但是后期抑制力強(qiáng)于VC，所以最終烏欖葉黃酮和VC的ORAC值分別為（4 177.5±99.6）、（4 211.5±166.1）umol TE/g，差距較小。烏欖葉與VC相比較，具有更持久的抗氧化能力，可以作為持久的抗氧化劑。

2.6 對D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠氧化損傷的影響

2.6.1 對小鼠行為、體重的影響

烏欖葉黃酮對ICR小鼠體質(zhì)量的影響表見表1。

D-半乳糖致氧化損傷模型小鼠與空白組相比較逐漸表現(xiàn)出活動減少，毛色明顯變得灰暗粗糙并伴有脫毛現(xiàn)象；而其他組的小鼠總體狀態(tài)均優(yōu)于模型組。如表1所示，長期注射D-半乳糖對體重并沒有顯著的影響。其中模型組與空白組相比體重增加量有輕微的降低，而且烏欖葉黃酮給藥組與陽性組和空白組沒有顯著性差別。這表明長期給予烏欖葉黃酮對小鼠的體重變化沒有顯著影響。

表1 烏欖葉黃酮對ICR小鼠體質(zhì)量的影響（n=10）Table 1 Effects of TFCPL on body weight（g）of ICR mice（n=10）

2.6.2 對小鼠肝臟、腎臟和胰腺指數(shù)的影響

烏欖葉黃酮對肝臟、腎臟和胰腺指數(shù)的影響表見表2。

如表2所示，烏欖葉黃酮低、中、高劑量和VC均可使氧化損傷小鼠肝臟、腎臟和胰腺指數(shù)顯著增高（P＜0.05），但與空白組也具有差異（P＜0.05），表明雖然對損傷小鼠具有緩解作用，但是與空白組和陽性組相比仍然具有輕微的損傷。在腎臟指數(shù)中低劑量組與空白組具有顯著性差異（P＜0.05）說明低劑量組對于小鼠腎臟損傷的緩解作用較弱。

2.6.3 對小鼠血清 T-AOC、MDA含量及 GSH-Px、SOD活性的影響

烏欖葉黃酮對小鼠血清T-AOC、MDA含量及GSH-Px、SOD活性的影響表見表3。

表2 烏欖葉黃酮對肝臟、腎臟和胰腺指數(shù)的影響（n=10）Table 2 Effects of TFCPL indices of liver，kidney and pancreas of mice（n=10）

表3 烏欖葉黃酮對小鼠血清T-AOC、MDA含量及GSH-Px、SOD活性的影響（n=10）Table 3 Effects of TFCPL on serum T-AOC，MDA content and GSH-Px，SOD activity（n=10）

如表3所示，模型組的T-AOC顯著低于空白組小鼠（P＜0.05），表明D-半乳糖可以破壞抗氧化系統(tǒng)并加速衰老過程。烏欖葉黃酮不同劑量組的T-AOC明顯高于模型組小鼠（P＜0.05），而且與空白組無顯著性差異（P＞0.05）。與空白組相比，模型組小鼠血清中MDA含量顯著增加（P＜0.05），表明D-半乳糖成功建立了小鼠衰老動物模型；隨著其濃度的增加MDA含量減低，而且與模型組比，3個劑量對血清中MDA含量均有顯著差異（P＜0.05）。與空白組相比，模型組顯著降低SOD和GSH-Px活性（P＜0.01）；烏欖葉黃酮不同劑量組中小鼠的SOD、GSH-Px活性高于模型組，而且中劑量組和高劑量組與空白組無明顯的差異（P＞0.05），而低劑量效果不明顯。表明烏欖葉對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠SOD、GSH-Px活性具有恢復(fù)作用。因此烏欖葉具有改善衰老小鼠氧化應(yīng)激的作用。

2.6.4 對小鼠肝組織病理改變的影響。

烏欖葉黃酮對D-半乳糖誘導(dǎo)損傷小鼠肝臟組織的影響圖見圖8。

圖8 烏欖葉黃酮對D-半乳糖誘導(dǎo)損傷小鼠肝臟組織的影響（HE，200×）Fig.8 Effect of TFCPL on liver histology in D-gal-treated mice（HE，200×）

空白組小鼠的肝組織的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常而且有明顯的邊界，肝細(xì)胞呈條索狀排列[圖8（A）]。模型組小鼠肝臟出現(xiàn)一定程度的損傷，肝細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞間隙增大，少量細(xì)胞核碎裂或固縮和氣球變性等病理損傷，還觀察到具有其他損傷，如病灶性壞死，淋巴細(xì)胞浸潤[圖8（B）]。在烏欖葉黃酮低劑量組發(fā)現(xiàn)有明顯的氣球樣變性和纖維化的改善[圖8（D）]；中劑量組肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，肝組織結(jié)構(gòu)變得明顯，細(xì)胞間隙減少[圖8（E）]；高劑量組和陽性對照組的改善更為顯著，其中炎性細(xì)胞浸潤得到緩解，接近與正常細(xì)胞 [圖8（C）、圖（F）]。結(jié)果表明烏欖葉黃酮可以有效改善肝臟組織病理學(xué)損傷，而且呈濃度依賴性。

5 結(jié)論

本研究對烏欖葉黃酮體外抗氧化能力進(jìn)行了評價，結(jié)果證明其與VC、BHT抗氧化能力相當(dāng)，且與質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，表明其在體外具有較強(qiáng)的抗氧化活性。氧化應(yīng)激引起的自然衰老可以通過長期給予D-半乳糖模擬，烏欖葉黃酮可以通過改變D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠血清中T-AOC，MDA，SOD和GSH-PX水平來改善氧化應(yīng)激防御和抑制細(xì)胞凋亡，顯著調(diào)節(jié)氧化損傷小鼠的抗氧化酶活性和過氧化物質(zhì)的含量；此外，烏欖葉黃酮顯著減弱肝臟的組織病理學(xué)變化。本研究表明烏欖葉黃酮可以作為食品和治療中的新型天然抗氧化劑；也為以后烏欖葉在食品、藥品以及保健品方面的研究提供了理論和試驗基礎(chǔ)；其產(chǎn)生抗氧化作用的途徑和通路，需要進(jìn)一步的研究。