韓雨婷，吳怡婷，李睿佳，趙亮，張明，*

（1.北京工商大學食品學院，北京100048；2.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

口腔致病菌黏附和生物膜的形成，是口腔疾病發(fā)病的重要原因之一，通過常規(guī)手段難以根治。近年來，齲病、牙周病等口腔疾病發(fā)病率逐年上升。牙齒修復或正畸治療后帶來的菌群失調等口腔問題也日益突出[1]，而常見的口腔疾病的發(fā)生與口腔致病菌的定植擴散有著密切的關聯(lián)。變異鏈球菌和戈氏鏈球菌是主要致病菌，它們通過分泌黏附素初步黏附在牙齒表面[2]，形成生物膜，進而通過產酸和其他代謝物損傷牙體及其周圍組織，從而誘發(fā)齲齒等口腔疾病[3]。目前控制口腔疾病的主要方法有機械去除法和抗菌藥物的應用。然而，生物膜對抗菌藥物有很強的抵抗力，機械去除法有效但很難長期維持[4]。

乳酸菌在口腔中的黏附定植是抑制口腔致病菌黏附的有效措施。黏附和聚集能力是在開發(fā)新菌株的關鍵。唾液鏈球菌是一種非致病性和數量上占優(yōu)勢的口腔種類，是開發(fā)口腔模型益生菌的理想候選者[5]。唾液鏈球菌K12非常適合用作口腔益生菌，因為其天然傾向于居住在人類口腔中并且與許多適應性相同的口腔病原體具有強烈競爭力[6]。已有研究表明產生細菌素的K12對引起口臭的細菌具有明顯抗菌活性[7]。此外，Moon等的體外抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)益生菌K12對引起口腔疾病的口腔細菌在一定濃度范圍內表現(xiàn)了顯著的抑菌活性[8]。副干酪乳桿菌是對變形鏈球菌具有最大干擾能力的物種之一[9]，已有研究表明副干酪乳桿菌F19對5種變形鏈球菌菌株均有抑制作用[10]。一項臨床醫(yī)學研究表明口服副干酪乳桿菌GMNL-33兩周后唾液中的變異鏈球菌被顯著抑制[11]。但是，目前國內尚未有關于副干酪乳桿菌抑制口腔致病菌的研究。

關于益生菌對口腔致病菌的抑制，國內常見的研究方法主要是牛津杯法測定抑菌圈[12]，但該法并不能模擬真實口腔環(huán)境。在已有文獻中用到的幾種黏附介質唾液包被的微量滴定板[13]、有機溶劑[14]、口腔上皮細胞[15]等，與牙齒的成分似乎相差甚遠，唾液包被的羥磷灰石珠子[16]和羥磷灰石圓盤[17]是體外研究齲齒防治的最佳選擇，唾液包被的羥磷灰石模型能較高水平模擬口腔牙齒環(huán)境。已有研究中對于變異鏈球菌黏附量的測定，常用的方法有平板計數法[18]和35 S-甲硫氨酸代謝標記計數法[19]。但是平板計數僅限于檢測活細菌數量，標記法也局限于它對細菌的標記效率。而實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一套能夠快速、準確鑒別細菌的鑒定方法。

副干酪乳桿菌L9是一株從長壽老人糞便中分離得到的益生菌株，已有試驗證明該菌株具有較高的安全性[20]。目前對于L9的研究主要集中于腸道益生功能[21]。本試驗通過構建口腔細菌的體外黏附模型，建立實時熒光定量PCR特異性檢測致病菌的方法，以唾液鏈球菌K12作為陽性對照，評估副干酪乳桿菌L9對口腔中主要致病菌（變異鏈球菌和戈氏鏈球菌）的抑制黏附作用。本研究將為副干酪乳桿菌在口腔疾病預防領域的應用提供直接的理論證據和支持；也將為益生菌口腔護理產品的開發(fā)提供一定的應用指導和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)

本試驗中選用了兩株致病菌分別為戈氏鏈球菌1.2496（Streptococcus gordonii1.2496，S.gordonii）、變異鏈球菌 1.2499（Streptococcus mutans1.2499，S.mutans）均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，使用BHI培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，兩株益生菌分別為副干酪乳桿菌L9（Lactobacillus paracasei L9，L9）和唾液鏈球菌K12（Streptococcus salivarius，K12），其中副干酪乳桿菌L9分離自廣西巴馬長壽老人腸道，使用MRS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，唾液鏈球菌K12購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，使用M17培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。以上所有菌株均以20%脫脂乳形式保存于-20℃，取200 μL于相應培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，并傳代。

1.2 材料與試劑

羥基磷灰石（80 μL）：日本 Bio-Rad Laboratories公司；羥磷灰石圓盤（5 mm×2 mm）：美國 Clarkson Chromatography公司；細菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：天根生化科技有限公司；SYBRGREEN 1染料：寶日醫(yī)生物技術公司；細菌存活率染色試劑盒：賽默飛世爾科技公司；溶菌酶（＞20 000 U/mg）：生工生物工程有限公司；牛血清蛋白：科奧科技有限公司。

1.3 儀器與設備

Light CyclerR96Real-Time PCR儀：瑞士羅氏公司；A1RMP共聚焦掃描顯微鏡：尼康映像儀器銷售有限公司；Infinite M200PRO酶標儀：瑞士Tecan公司；pH211酸度計：意大利哈納科儀公司；3K3O低溫高速離心機：德國Satorious公司；DK-8B電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；JY-ECP3000電泳儀：河南兄弟設備有限公司；Mini SC電泳槽：北京凱元信瑞儀器有限公司；Bioscreen C全自動生長曲線儀：百奧斯科林公司；MCO-12AC CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司。

1.4 方法

1.4.1 致病菌特異性引物篩選及標準曲線制作

通過查找文獻獲得6對變異鏈球菌引物，引物信息如表1、2所示，通過定量PCR篩選出能夠特異性擴增變異鏈球菌和戈氏鏈球菌，但不能擴增唾液鏈球菌和副干酪乳桿菌的特異性引物。

表1 致病菌引物表[22-25]Table 1 The table of specific primers for pathogenic bacteria

表2 引物反應體系及反應條件[22-25]Table 2 Reaction system and reaction conditions of primers

使用特異性引物對致病菌進行定量PCR，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并使用膠回收試劑盒回收DNA，測定標準DNA濃度并進行10倍梯度稀釋8次，以此作為模板進行定量PCR，最后以各梯度稀釋液中DNA的拷貝數濃度的對數為橫坐標，以擴增循環(huán)數Ct值為縱坐標，制作標準曲線。

1.4.2 唾液預處理

唾液收集，選擇10名24歲～40歲的健康志愿者，收集唾液。健康成人在進食2 h后用清水漱口，利用唾液收集管收集無刺激性唾液（口含棉棒10 min），低溫高速離心機4℃5 500 r/min離心15min，取上清液，以0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，收集的唾液部分與0.1 mol/L的氯化鉀緩沖液1∶1等體積混合，用于羥磷灰石模型，部分與PBS 1∶1等體積混合用于生物膜形成。均保存于-20℃?zhèn)溆?，長期存放于-80℃。志愿者要求如下[26]：

無吸煙歷史，在收集前1 h內沒有進食、飲水、飲酒等；沒有正在生病、沒有正在服用藥物，尤其1個月內未服用抗生素類藥物；3 d內未食用酸奶、益生菌飲料；無齲病、牙周病等口腔疾患。

1.4.3 羥基磷灰石模型黏附試驗

操作如圖1所示，準確稱量10 mg羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）珠子于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL 氯化鉀緩沖液（50.0 mmol/L KCl，0.35 mmol/L K2HPO4，0.65mmol/LKH2PO4，1.0mmol/LCaCl2，0.1mmol/L MgCl2，pH6.5）中浸泡過夜，次日吸去緩沖液加入100μL已處理好的唾液，室溫下6 r/min旋轉1 h后吸去唾液，200 μL緩沖液洗滌兩次并吸干緩沖液，加入100 μL含5mg/mL牛血清蛋白的氯化鉀緩沖液，室溫下6 r/min旋轉30 min后吸干，氯化鉀緩沖液洗滌2次，即制成唾液包被的羥磷灰石模型。

傳代的第二代菌室溫2 500 r/min離心15 min，收集細菌，氯化鉀緩沖液洗菌兩次，懸浮于含有5 mg/mL牛血清蛋白的氯化鉀緩沖液中，制成菌濃度為107cfu/mL的菌懸液備用。將試驗分為兩組預防組和治療組：預防組為加入益生菌懸浮液125 μL旋轉作用1 h后加入致病菌懸浮液125 μL；治療組為加入致病菌懸浮液125 μL旋轉作用1 h后加入益生菌懸浮液125 μL；空白對照組則用含5 mg/mL牛血清蛋白的氯化鉀緩沖液代替益生菌懸浮液。室溫6 r/min旋轉2、6、18 h，氯化鉀緩沖液洗滌2次，收集羥磷灰石珠子進行定量PCR，收集緩沖液測定pH值，每組3次重復。

圖1 試驗流程圖Fig.1 Schematic diagram of the experiment process

1.4.4 共聚焦激光顯微鏡檢測生物膜

基于以上羥磷灰石黏附模型的研究結果，進行L9、K12抑制變異鏈球菌生物膜形成的試驗。方法如圖1所示，細菌在37℃接種兩代至生長對數期4 500 r/min離心 10 min棄上清，PBS（4℃，4 500 r/min，10 min）洗滌2次，懸浮于含有質量分數為0.2%的蔗糖的人造唾液培養(yǎng)基[27]中，制成菌濃度為107cfu/mL的菌懸液備用。高壓滅菌的圓盤置于24孔組織培養(yǎng)板的孔中（每孔中一個圓盤，圓盤不可接觸孔壁），37℃用上述唾液（1.5 mL/孔）包衣4 h，1.5 mL PBS沖洗2次。加入細菌懸浮液各750 μL，在羥磷灰石圓盤表面培養(yǎng)24 h形成生物膜。

將圓盤依次用1.5 mL無菌PBS（每次漂洗的浸泡時間，10 s）沖洗3次，以除去非黏附細菌；使用安裝在無振動平臺上的488 nm Ar/Ar-Kr激光掃描頭的TCS SP2共聚焦顯微鏡進行非侵入式共聚焦成像。使用的物鏡是20×，圖像三倍放大；樣本進行LIVE/DEAD染色使用RBacLightTM細菌活力試劑盒。染色時間為（9±1）min，染色比例為 1∶1，獲得在相應波長[Syto9：515nm ～530 nm ；碘化丙啶（PI）：＞ 600 nm]下的最佳熒光信號；選擇覆蓋有生物膜的圓盤上至少3個獨立且具有代表性的位置進行這些測量（基于在共聚焦視場中標識的堆疊或“塔”）。在每個區(qū)域內，通過確定生物膜的上限和下限來測量最厚的點。CLSM軟件被設置為采用1 μm 厚度的 z系列掃描（xyz）（8位，1 024× 1 024像素）。為了量化生物膜內的生物量和細胞生存力，使用NIS Viewer軟件程序進行分析共聚焦顯微照片。手動設置每種熒光顏色的熒光強度閾值[28]。

1.5 數據處理

所有試驗結果均表示為均值±方差，每組試驗3個平行進行3次重復，使用EXCEL軟件處理數據作圖，使用23.0版SPSS軟件進行顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 變異鏈球菌和戈式鏈球菌定量檢測方法的建立

2.1.1 特異性引物篩選

針對6對引物，通過篩選并驗證得到1對引物B2能對變異鏈球菌和戈氏鏈球菌進行特異性擴增，電泳圖如圖2所示，變異鏈球菌和戈氏鏈球菌在200 bp附近有條帶，其他均無條帶出現(xiàn)。

圖2 引物B2擴增產物電泳圖Fig.2 Electropherogram of the amplified product of the primer B2

圖3 B2引物對4株菌的擴增曲線和溶解曲線Fig.3 Amplification curve and dissolution curve of 4 strains amplified by the primer B2

用B2引物對4株菌的擴增曲線和溶解曲線如圖3，其中圖3（a）中擴增曲線3和4的Ct值均大于30，認為該引物不能擴增出副干酪乳桿菌L9和唾液鏈球菌K12。因此，應用篩選得到的引物B2能對致病菌益生菌混合體系中的致病菌含量進行特異性檢測。

2.1.2 標準曲線建立

以引物B2定量擴增變異鏈球菌和戈氏鏈球菌得到的標準曲線如圖4所示。變異鏈球菌擴增標準曲線為y=-3.558 1x+58.998，R2=0.998 2；戈氏鏈球菌擴增標準曲線為y=-3.693x+60.528，R2=0.997 7?？捎糜谧儺愭溓蚓透晔湘溓蚓亩繖z測。

2.2 L9對致病菌的抑制黏附效果

圖4 戈氏鏈球菌、變異鏈球菌Ct值與DNA濃度對數值的線性關系Fig.4 Linear relationship between the logarithm of DNA concentration and the Ct value of S.gordonii and S.mutans

預防組結果如圖5（a）和（b），加入兩株益生菌與戈氏鏈球菌相互作用2、6、18h后，戈氏鏈球菌含量與不加益生菌的對照組相比顯著降低（p＜0.05），充分證明了K12和L9對戈氏鏈球菌均具有顯著預防黏附作用。在相互作用2h時，與陽性對照K12組（3.04×109cfu/mL）相比，L9對戈式鏈球菌的抑制作用顯著高于k12（p＜0.05），戈氏鏈球菌降低到了2.05×109cfu/mL。而在6 h時L9組戈氏鏈球菌黏附量（2.63×109cfu/mL）顯著高于K12組（1.51×109cfu/mL），18 h兩組益生菌組的抑制黏附作用無顯著性差異（p＞0.05）；對于變異鏈球菌，與對照組相比，兩株益生菌在加入2 h和6 h后，變異鏈球菌含量均顯著降低（p＜0.05），黏附2 h時K12組和L9組分別降低了 0.36×109cfu/mL和0.93×109cfu/mL，6 h分別降低了 2.76×109cfu/mL 和 1.49×109cfu/mL，兩株菌對變異鏈球菌的抑制作用差異不顯著（p＞0.05），作用18h后，K12組的變異鏈球菌含量與對照組無顯著性差異（p＞0.05），而加入L9的試驗組中變異鏈球菌的含量（2.46×109cfu/mL）顯著低于對照組（4.26×109cfu/mL）和 K12 組（4.09×109cfu/mL）（p＜0.05）。

圖5 致病菌濃度隨黏附時間的變化Fig.5 Changes in concentration of pathogenic bacteria with adhesion time

A.Hankioja等的研究發(fā)現(xiàn)加入益生菌后變異鏈球菌計數顯著減少，而戈氏鏈球菌反而受到較小的影響[29]。這一結果在本試驗治療組中有同樣體現(xiàn)。治療組如圖 5（c）、（d）中，對照組與益生菌 L9 和 K12 組的結果均無顯著性差異（p＞0.05）；而對于變異鏈球菌，K12對其抑制不顯著（p＞0.05），反而L9在作用2h后顯著抑制了變異鏈球菌的含量（p＞0.05）。我們推測產生這種差異的原因可能是由于不同益生菌在唾液中的結合位點是有差異的，從而對致病菌黏附產生不一樣的抑制效果。

本試驗結果顯示無論是變異鏈球菌還是戈氏鏈球菌，預防黏附的效果均優(yōu)于治療黏附的效果。相對于簡單的細菌體外共培養(yǎng)試驗[30]，本試驗模擬預防和治療的設計更具有實際意義。加入益生菌的先后影響了致病菌的黏附，該結果表明益生菌在口腔中起到的抑制作用并非是簡單的非特異性空間位阻[31-33]，而很可能是益生菌能夠與致病菌競爭性結合唾液獲得性膜上的蛋白受體，從而減少致病菌的黏附量。當然，益生菌的具體黏附機制和競爭受體的特異性仍需進一步研究證明。

2.3 pH值測定結果

由于乳酸桿菌是產酸性和酸性細菌，它們與口腔疾病密切相關[34-36]。本研究測定了兩株益生菌菌在黏附過程中對緩沖液 pH 值的影響，圖 6（a）、（b）結果顯示在預防戈氏鏈球菌組中，在0 h益生菌組緩沖液pH值均顯著高于0 h的對照組（p＜0.05），18 h后三組間無顯著性差異（p＞0.05）；預防變異鏈球菌組中0 h和18 h均無顯著差異。而在治療組圖6（c）、（d）中，與變異鏈球菌和戈氏鏈球菌對照組相比，唾液鏈球菌K12組pH值均顯著降低（p＜0.05），黏附培養(yǎng)18 h后，L9組pH值顯著低于對照組（p＜0.05）。該結果說明L9和K12預防致病菌黏附的過程中不會增加產酸，這可能與其抑制致病菌的定植和乳酸釋放有關[37]。而在治療過程中，它們可能有酸化口腔環(huán)境的不良作用，唾液鏈球菌K12酸化作用更嚴重。

圖6 緩沖液pH值的變化Fig.6 Changes in pH value

圖7 羥磷灰石圓盤形成生物膜厚度及其示意圖Fig.7 Thickness and Schematic diagram of the biofilm formed on the hydroxyapatite disc

2.4 激光共聚焦檢測生物膜結果

成熟的牙菌斑生物膜是導致口腔疾病發(fā)生的主要因素，從圖7（a）中可以看出，與對照組相比，益生菌組（L9和K12）在羥磷灰石表面形成的生物膜厚度均顯著降低（p＜0.05），且K12與L9組的生物膜厚度沒有顯著性差異。對照組的平均厚度為16.33 μm，L9和K12組平均厚度分別為12.63 μm和13.13 μm。圖7（b）、（c）、（d）顯示對照組細菌生物膜密度明顯高于其他試驗組，細菌密集成大片云狀，層層疊疊，比較聚集。而加入L9和K12的試驗組細菌菌落較分散，暗黑的空隙范圍很大，細菌分布零亂，尤其是L9組細菌呈現(xiàn)零星點狀，比K12組形成的細菌密度更小。因此，副干酪乳桿菌L9和唾液鏈球菌K12能夠通過抑制變異鏈球菌的黏附，減少牙菌斑生物膜的產生，從而預防口腔疾病的發(fā)生。

3 結論

綜上所述，本研究證明了副干酪乳桿菌L9能夠在不影響環(huán)境酸度的前提下預防變異鏈球菌和戈氏鏈球菌對羥基磷灰石珠子的黏附，能夠顯著降低致病菌在載體表面形成的生物膜量，且總體來看，L9抑制致病菌黏附效果優(yōu)于陽性對照K12組，且致酸性弱。因此，副干酪乳桿菌L9可以作為一種預防口腔致病菌的潛在手段，但這種抑制機制和臨床防治效果仍需深入探究。