楊重暉，趙大慶，王德慧，荊禮，唐曉雷，孫偉杰，潘黛安，劉莉，*，齊濱，*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐中心，吉林長春130117；4.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長春130117）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬多年生灌木，是我國西北地區(qū)的一種野生植物，分布范圍較廣，分布于寧夏、新疆、西藏、青海、內(nèi)蒙、甘肅等地，其味甘、性平。其果實(shí)含豐富的維生素、多糖、黃酮、類黃酮、微量元素、天然原花青素等多種活性成分[1-3]。近年來，黑果枸杞的藥理作用受到了廣泛的關(guān)注，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黑果枸杞的生理活性與花青素類天然色素、甜菜堿、多糖類等成分有關(guān)[4-6]。

黑果枸杞中含有豐富的氨基酸，氨基酸是枸杞果實(shí)中主要的營養(yǎng)及藥用成分，其含量是評價(jià)食品和中藥材品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[7-9]。黑果枸杞中含有多種氨基酸，其中以天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量較高，而且多數(shù)呈游離狀態(tài)。游離氨基酸約占氨基酸總量的50%。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，現(xiàn)有研究結(jié)果表明黑果枸杞中的蛋白質(zhì)也可能是重要的活性成分。近年來，中藥蛋白質(zhì)被證明是一些中藥中主要的活性成分，具有抗真菌，抗氧化，增強(qiáng)免疫等功效[10-11]。但目前黑果枸杞中蛋白質(zhì)的提取工藝鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)通過響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化黑果枸杞蛋白的提取工藝，并對黑果枸杞蛋白的抗衰老活性進(jìn)行了初探。本試驗(yàn)結(jié)果可為該植物蛋白的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞：廣州漢草薈生物科技有限公司，批號20170914，產(chǎn)自青海柴達(dá)木。黑果枸杞由長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為茄科植物黑果枸杞的干燥果實(shí)。

Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（gutathion peroxidase，GSH-Px）試劑盒：南京建成科技有限公司；D-半乳糖：上海恒信化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

DT100型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；JB-1B型磁力攪拌器：上海雷磁新涇儀器有限公司；DS-1型勻漿機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；CENTRIFUGE 580離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀：Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑果枸杞蛋白的制備

將黑果枸杞稱重，粉碎，用30 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液4℃浸提1 h，浸提液7 000 r/min離心，收集上清液，用膜孔徑為0.45 μm的中空纖維膜過濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾，將收集的濾液用截留分子量為10kDa的中空纖維膜過濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾、濃縮，將內(nèi)濾液冷凍干燥后即得黑果枸杞蛋白[12-18]。

1.2.2 黑果枸杞蛋白的含量測定

按考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）[19-21]以蛋白濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定黑果枸杞蛋白的含量，計(jì)算提取率。

1.2.3 黑果枸杞蛋白提取單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 不同pH值的緩沖溶液對黑果枸杞蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱量5 g黑果枸杞粉于試管中，按照液料比15∶1（mL/g）向每個(gè)試管加入 pH 值為 6、7、8、9 的緩沖溶液，在4℃下浸提18 h，浸提2次，過濾，離心30 min，取上清液測定蛋白含量，計(jì)算提取率，確定浸提溶液的pH值。

1.2.3.2 不同浸提時(shí)間對黑果枸杞蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱量5 g黑果枸杞粉于試管中，按照液料比15∶1（mL/g）向各試管加入pH值為7的緩沖溶液，在4 ℃下浸提 2 次，每次浸提 6、12、18、24 h，過濾，離心30 min，取上清液測定蛋白含量，計(jì)算提取率，確定浸提時(shí)間。

1.2.3.3 不同液料比對黑果枸杞蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱量5 g黑果枸杞粉于試管中，按照液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）向各試管加入 pH 值為 7 的緩沖溶液，在4℃下浸提2次，浸提18 h，過濾，離心30 min，取上清液測定蛋白含量，計(jì)算提取率，確定浸提液料比。

1.2.3.4 不同浸提次數(shù)對黑果枸杞蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱量5 g黑果枸杞粉于試管中，按照液料比15∶1（mL/g）向各試管加入pH值為7的緩沖溶液，在4 ℃下浸提 18 h，提取次數(shù)分別為 1、2、3、4 次，過濾，離心30 min，取上清液測定蛋白含量，計(jì)算提取率，確定浸提次數(shù)。

1.2.4 黑果枸杞蛋白提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面法中Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[22-25]，以浸提時(shí)間、浸提次數(shù)、液料比為自變量，蛋白提取率為因變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面法分析試驗(yàn)，確定黑果枸杞色素提取的最佳工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

對響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的黑果枸杞蛋白提取工藝結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以驗(yàn)證提取工藝的可靠性。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)動物分組和給藥劑量

昆明種清潔級小鼠，雌雄各半，體重18 g～22 g。動物質(zhì)量合格編號：SCXK-2012-0002，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。小鼠自由攝食和飲水，試驗(yàn)開始前讓小鼠先適應(yīng)1周，檢查合格后開始進(jìn)入正式試驗(yàn)。取50只昆明種小鼠，按體重隨機(jī)分成5組，每組雌鼠5只，雄鼠5只。5組分別為空白對照組（control），老年模型組（aging model，AM），黑果枸杞蛋白低劑量組（LRP-LG），黑果枸杞蛋白中劑量組（LRP-MG）和黑果枸杞蛋白高劑量組（LRP-HG）?？瞻讓φ战M每天灌胃等體積的蒸餾水，其他實(shí)驗(yàn)組頸背部皮下注射濃度為1 000 mg/（kg·d）的D-半乳糖，連續(xù)注射30 d后，老年模型組灌胃蒸餾水[10 mL/（kg·d）]，低中高劑量組分別灌胃濃度為125、250、500 mg/（kg·d）的黑果枸杞蛋白樣品，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.7 生化指標(biāo)的測定

禁食12 h以后，處死小鼠，立即眼球取血，收集血清利用試劑盒提供的方法測定SOD、GSH-Px、CAT的活力以及MDA的含量。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 黑果枸杞蛋白的含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示，y=13.107x+0.009 6，R2=0.999 4。

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 緩沖溶液的pH值對黑果枸杞蛋白提取率的影響緩沖溶液的pH值對黑果枸杞蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 pH值對黑果枸杞蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH value on the protein extraction rate of Lycium ruthenicum

緩沖液的pH值對蛋白提取率具有重要影響，由圖2可見，緩沖溶液pH值為7時(shí)蛋白提取率最高，pH值為6、8和9時(shí)蛋白提取率均急劇下降，故確定緩沖溶液最優(yōu)pH值為7。

2.2.2 浸提時(shí)間對黑果枸杞蛋白提取率的影響

浸提時(shí)間對黑果枸杞蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 浸提時(shí)間對黑果枸杞蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the protein extraction rate of Lycium ruthenicum

由圖3可見，隨著浸提時(shí)間的增加，蛋白提取率隨之增加。浸提6 h到浸提12 h蛋白提取率升高較快，浸提12 h到浸提24 h蛋白提取率升高放緩，考慮到浸提時(shí)間過短可能導(dǎo)致蛋白提取不充分，故確定最優(yōu)值應(yīng)存在于 12 h～24 h。

2.2.3 液料比對黑果枸杞蛋白提取率的影響

液料比對黑果枸杞蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對黑果枸杞蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid/solid ratio on the protein extraction rate of Lycium ruthenicum

液料比對蛋白提取率有著重要影響，由圖4可見，液料比 5∶1（mL/g）～15∶1（mL/g）區(qū)間蛋白提取率升高較快，液料比 20∶1（mL/g）時(shí)提取率增長放緩，說明在此比例下蛋白溶出趨于飽和，故確定最優(yōu)值存在于10∶1（mL/g）～20∶1（mL/g）之間。

2.2.4 浸提次數(shù)對黑果枸杞蛋白提取率的影響

浸提次數(shù)對黑果枸杞蛋白提取率的影響見圖5。

圖5可見，浸提3次與浸提4次蛋白提取率幾乎相同，浸提次數(shù)過多不僅浪費(fèi)成本還可能導(dǎo)致提取蛋白中雜質(zhì)增多，故確定最優(yōu)值存在于1次～3次之間。

圖5 浸提次數(shù)對黑果枸杞蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction times on the protein extraction rate of Lycium ruthenicum

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，由于存在明顯的緩沖溶液最優(yōu)pH值，故而在響應(yīng)面試驗(yàn)中不再考察此項(xiàng)。選取響應(yīng)面試驗(yàn)因素為A提取時(shí)間、B提取次數(shù)、C液料比，提取率為響應(yīng)值，采用Design-expert 8.0.6.1軟件按照Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)，12組為析因點(diǎn)試驗(yàn)，5組為重復(fù)零點(diǎn)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface experimental results

運(yùn)用Design Expert8.0.6.1軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析，得到黑果枸杞蛋白提取率預(yù)測值（Y）對自變量A、B和C的二次多項(xiàng)回歸方程模型：

Y=-13.15+0.83A+5.76B+0.84C+0.01AB+0.01AC-0.01BC-0.02A2-1.35B2-0.03C2

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從方差分析結(jié)果可知（見表3），模型回歸項(xiàng)p＜0.05，說明所選擇模型顯著。各因素的影響大小為A提取時(shí)間＞C液料比>B提取次數(shù)，表中的A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2的 p 值均小于 0.05，說明這些均是較顯著的模型項(xiàng)。模型失擬項(xiàng)p＞0.05，不顯著，表示試驗(yàn)誤差小，操作可行，模型對試驗(yàn)擬合情況較好?；貧w方程能夠擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系?？梢酝ㄟ^回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。模型的的絕對系數(shù)R2=0.999 6，說明響應(yīng)值的變化有99.96%來自于所選變量優(yōu)化，因此回歸方程可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

各因素的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖6～圖7。

該圖組可直觀地反映各因素及其交互作用對蛋白得率大小的影響程度。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素間交互作用較弱，橢圓表示兩因素間交互作用較強(qiáng)。

圖6 提取時(shí)間與提取次數(shù)交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 The response surface and contour map of extraction time and extraction times

圖7 提取時(shí)間與液料比交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 The response surface and contour map of extraction time and liquid/solid ratio

由圖6～圖8可以看出，隨著各個(gè)因素值的增加，提取率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢且響應(yīng)面存在最高點(diǎn)，說明所篩選范圍存在極值。由圖6可以看出提取次數(shù)曲面比提取時(shí)間曲面坡度陡峭，說明提取次數(shù)對蛋白提取率的影響比提取時(shí)間的影響大。由圖7可以看出提取時(shí)間比液料比對蛋白提取率的影響大，圖8中提取次數(shù)與料液比的曲面坡度陡峭程度一致，說明兩因素對蛋白提取率影響一致。以上結(jié)果分析均與二元回歸方程系數(shù)相符合。

圖8 提取次數(shù)與液料比交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 The response surface and contour map of extraction times and liquid/solid ratio

通過軟件Design-Expert 8.0.6.1求解方程，得出了最優(yōu)提取工藝條件：提取時(shí)間20.82 h，提取次數(shù)2.11次，液料比 16.59∶1（mL/g），提取率預(yù)測值 8.53%。為了便于進(jìn)行試驗(yàn)，對該條件進(jìn)行修正：提取時(shí)間21 h，提取次數(shù) 2 次，液料比 17∶1（mL/g）。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照修正試驗(yàn)條件重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，最終蛋白提取率為8.62%，與預(yù)測值相差0.01%。結(jié)果說明模型與試驗(yàn)擬合程度良好，由模型優(yōu)化得出的最佳工藝具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.4 小鼠體征和行為結(jié)果

造模前各組小鼠皮毛光亮、行動活潑、飲食正常。造模1周后，與空白對照組相比，模型組小鼠食欲減退、形體消瘦、體重減輕、毛色灰暗、豎毛、活動減少，呈現(xiàn)明顯的衰老體征。給藥黑果枸杞蛋白后，與衰老模型組對比，給藥30 d后，黑果枸杞蛋白各劑量組小鼠皮毛較光亮、活潑、納食正常，與空白對照組小鼠相比，行為體征無明顯差異。

2.5 小鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果

黑果枸杞蛋白對小鼠GPX、SOD、CAT和MDA的影響見表4。

衰老模型組與空白對照組相比，血清中GSH-Px、SOD活性顯著下降（p＜0.01），CAT活性明顯下降（p＜0.05），MDA含量顯著上升（p＜0.01），證明小鼠衰老模型成立。

在本次試驗(yàn)結(jié)果中不難看出，與老年模型組相比，黑果枸杞蛋白高劑量組可顯著提升GSH-Px、SOD和 CAT 活性（p＜0.01）并降低 MDA 含量（p＜0.01）；黑果枸杞蛋白中劑量組能顯著提高GSH-Px活性（p＜0.01），顯著降低MDA含量（p＜0.01）；黑果枸杞低劑量組能夠顯著提升 GSH-Px活性（p＜0.01），SOD 和 CAT活性升高明顯（p＜0.05），結(jié)果表明黑果枸杞蛋白高劑量組緩解衰老的效果較好，可提升GSH-Px、SOD以及CAT活性，且使細(xì)胞中MDA含量下降到正常水平從而達(dá)到延緩衰老的作用。

表4 黑果枸杞蛋白對小鼠GPX、SOD、CAT和MDA的影響Table 4 Effects of LRP on GPX，SOD，CAT and MDA in mice

3 結(jié)論與討論

本研究通過單因素試驗(yàn)得出響應(yīng)面優(yōu)化條件，得出黑果枸杞蛋白提取最佳條件為pH值為7，提取時(shí)間21 h，提取次數(shù) 2 次，液料比 17∶1（mL/g），在最優(yōu)條件下，蛋白提取率為8.62%，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

老化是調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào)的結(jié)果，代謝失調(diào)會導(dǎo)致多種心腦血管疾病，以及其他器官的疾病，而這些都與體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。自由基學(xué)說是具有代表性的衰老學(xué)說之一，該理論認(rèn)為，隨著年齡的增長，體內(nèi)自由基平衡體系逐漸被破壞，造成自由基過剩。過量自由基可通過過氧化作用攻擊細(xì)胞膜及核酸、蛋白質(zhì)和酶類等生物大分子，引起細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，核酸及蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，DNA基因突變或復(fù)制異常及生物酶活力下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能嚴(yán)重受損以致衰老，甚至死亡。過量的D-半乳糖破壞并消耗機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，造成機(jī)體自由基過剩，此時(shí)，GSH-Px、SOD及CAT活性高低的變化可以反映機(jī)體抗氧化能力的大小，活性越高表示抗氧化能力越強(qiáng)，而MDA含量的高低則可以反映機(jī)體自由基累積及脂質(zhì)過氧化損傷的程度[26-27]。本試驗(yàn)中，我們建立了小鼠的衰老模型，所采用的皮下注射D-半乳糖方法是目前我國建立衰老模型最常用的方法之一。本研究通過小鼠體內(nèi)的GPX、SOD、CAT和MDA水平的變化來測定黑果枸杞蛋白對小鼠抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示：LRP能顯著降低MDA含量并提高SOD、GSH-Px和CAT活力，提示黑果枸杞蛋白可通過提高機(jī)體抗氧化能力和直接清除自由基等發(fā)揮其延緩衰老的作用，但其作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)為黑果枸杞的滋補(bǔ)功能和抗衰老的研究提供了一定理論依據(jù)。