寇艷波，劉慶亞，張 波，湯仁仙，王玉剛

肥胖已成為全球流行性疾病，其伴隨的各種并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著人類的身心健康[1-2]。肥胖發(fā)生的最直接原因就是能量物質(zhì)的攝入大于機(jī)體的消耗。能量物質(zhì)儲(chǔ)存于脂肪細(xì)胞內(nèi)，造成脂肪細(xì)胞肥大和增生，引發(fā)肥胖[3]。哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞主要分為3類：白色脂肪細(xì)胞、棕色脂肪細(xì)胞和米黃色脂肪細(xì)胞[4]。白色脂肪細(xì)胞通過(guò)胞內(nèi)單一的大脂滴儲(chǔ)存甘油三酯。棕色脂肪細(xì)胞通過(guò)解耦聯(lián)蛋白-1(uncoupling protein 1,Ucp1)將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮躘5]。米黃色脂肪細(xì)胞可以多個(gè)小脂滴的形式儲(chǔ)存能源物質(zhì)，又能夠高水平表達(dá)UCP1[6-7]。

米黃色脂肪和棕色脂肪能有效抵抗高脂飲食引起的肥胖[8-9]。由于棕色脂肪只存在于嬰兒期，而米黃色脂肪伴隨整個(gè)生命過(guò)程，因此，越來(lái)越多的研究者們提出促進(jìn)米黃色脂肪的形成將是防治肥胖的有效手段[10]。本研究旨在建立穩(wěn)定的脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞分化的方法，并從整體水平檢測(cè)脂肪前體細(xì)胞和米黃色脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的差異，為進(jìn)一步揭示米黃色脂肪細(xì)胞形成的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1材料小鼠脂肪前體細(xì)胞系3T3-L1購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心，細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑包括IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、地塞米松、吲哚美辛、羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸購(gòu)自Sigma，小鼠胰島素購(gòu)自Peprotech。油紅染料購(gòu)自Sigma，Ucp1、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, Pparγ)、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16 (PR domain containing 16, Prdm16)抗體購(gòu)自Abcam，內(nèi)參β-Actin抗體購(gòu)自Abclonal。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)小鼠脂肪前體細(xì)胞系3T3-L1培養(yǎng)選用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)程中添加10%胎牛血清以及100 U·mL-1的青霉素和0.1 mg·mL-1的鏈霉素。

1.2.2脂肪前體細(xì)胞系誘導(dǎo)分化培養(yǎng)小鼠脂肪前體細(xì)胞3T3-L1至細(xì)胞匯合，更換新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h使細(xì)胞接觸抑制。48 h后用無(wú)菌的PBS將細(xì)胞充分洗滌，換用新的含有米黃色脂肪細(xì)胞分化混合液(2 mg·L-1地塞米松、0.5 mM IBMX、1 μM羅格列酮、1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸、125 μM吲哚美辛、5 mg·L-1胰島素)的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)分化。最后換用含有5 mg·L-1胰島素，1 μM羅格列酮，1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞并隔日換液，于第8天左右完成脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞的分化。

1.2.3油紅染色用異丙醇配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的油紅母液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，溶液經(jīng)濾紙過(guò)濾后，按照6(油紅母液)∶4(水)的比例進(jìn)行稀釋，獲得油紅染色工作液。分化成熟的脂肪細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2遍后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定10 min。固定后的細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后加入體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇浸洗2 min。棄掉異丙醇后，加入油紅工作液染色15 min。棄掉油紅染液后，細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇再次洗滌至背景基本無(wú)色。顯微鏡觀察脂滴形成情況。

1.2.4熒光定量PCR收集分化前和分化后的3T3-L1細(xì)胞，提取RNA，取總RNA 1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，以不同組的cDNA為模板利用Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀檢測(cè)米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄情況，內(nèi)參為β-actin。引物序列如下：β-actin：5′ CGTTGACATCCGTAAAGACC 3′ 和5′ AACAGTCCGCCTAGAAGCA 3′；Ucp1：5′ AGA-GGTCGTGAAGGTCAGAATG 3′和5′ TGACATTTC-TCATTAGATTAGGGGT 3′；Pparγ：5′ TTCAAGGG-TGCCAGTTTCG 3′和5′ CCATCTTTATTCATCAG-GGAGG 3′；Prdm16：5′ GAGATGCTGACGGATACA-GAGGT 3′和5′ GGCGAGGTTTTGGTCATCAC 3′。

1.2.5Westernblot細(xì)胞經(jīng)含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解后，測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣總蛋白30 μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，用Ucp1、Pparγ、Prdm16一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后二抗孵育1 h再次洗滌后分別檢測(cè)目的蛋白存在。

2 結(jié)果

2.1脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞分化方法的建立生長(zhǎng)至匯合的3T3-L1細(xì)胞，經(jīng)48 h的接觸抑制后，更換含有米黃色脂肪細(xì)胞分化混合液的新鮮培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化48 h。誘導(dǎo)分化完成后，經(jīng)胰島素、羅格列酮和三碘代-L-甲狀腺原氨酸維持分化4 d，顯微鏡觀察脂滴形成情況。3T3-L1分化前為典型的成纖維狀，細(xì)胞輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)；分化后細(xì)胞體積明顯增大，呈圓形或橢圓形，且細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)清亮的小脂滴存在，見(jiàn)圖1A。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)細(xì)胞的分化效率，進(jìn)行了油紅染色，結(jié)果顯示分化后絕大多數(shù)細(xì)胞(>90%)均呈油紅染色陽(yáng)性，表明絕大多數(shù)細(xì)胞已完成分化，見(jiàn)圖1B。

2.2米黃色脂肪細(xì)胞的確定由于白色脂肪細(xì)胞內(nèi)也含有大量脂滴，因此油紅染色并不能完全確定分化后的脂肪細(xì)胞即為米黃色脂肪細(xì)胞。白色脂肪細(xì)胞和米黃色脂肪細(xì)胞的形成均受轉(zhuǎn)錄因子Pparγ的調(diào)控[11]，但是白色脂肪細(xì)胞和米黃色脂肪細(xì)胞在基因表達(dá)上呈現(xiàn)出很大的差異，米黃色脂肪細(xì)胞以高表達(dá)Ucp1和Prdm16為標(biāo)志。因此，接下來(lái)檢測(cè)分化后細(xì)胞中Ucp1、Pparγ和Prdm16的表達(dá)。如圖2A所示，分化過(guò)程中米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因Ucp1、Pparγ和Prdm16轉(zhuǎn)錄均明顯上調(diào)；與之相對(duì)應(yīng)的是，western blot結(jié)果顯示分化后的細(xì)胞與未分化細(xì)胞相比，Ucp1、Pparγ和Prdm16蛋白水平也呈現(xiàn)多倍的增加(圖2B)。通過(guò)本方法誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞高表達(dá)米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白，表明分化后的細(xì)胞為米黃色脂肪細(xì)胞。

A、B：未染色脂肪前體細(xì)胞和分化后脂肪細(xì)胞；C、D：油紅染色后脂肪前體細(xì)胞和分化后脂肪細(xì)胞。圖1 分化后脂肪細(xì)胞形態(tài)觀察及脂滴形成驗(yàn)證

A：熒光定量PCR檢測(cè)分化前后的脂肪細(xì)胞中Ucp1、Pparγ、Prdm16的轉(zhuǎn)錄； B：Western blot檢測(cè)分化前后Ucp1、Pparγ、Prdm16蛋白表達(dá)。圖2 米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的檢測(cè)

2.3米黃色脂肪細(xì)胞與脂肪前體細(xì)胞基因表達(dá)差異分析為進(jìn)一步研究米黃色脂肪細(xì)胞形成的調(diào)控機(jī)制，對(duì)脂肪前體細(xì)胞3T3-L1和分化后的米黃色脂肪細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析。數(shù)據(jù)分析時(shí)分為兩組，分別是未分化的3T3-L1和分化成熟的米黃色脂肪細(xì)胞，每組3個(gè)平行。DEG(different expression genes)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3A所示，分化前和分化后的3T3-L1基因表達(dá)情況出現(xiàn)明顯的差異；其中分化前與分化后相比，1 993個(gè)基因發(fā)生了明顯的上調(diào)，1 538個(gè)基因明顯下調(diào)表達(dá)，13 771個(gè)基因沒(méi)有明顯的上下調(diào)變化。進(jìn)一步分析表明，這些差異表達(dá)基因與細(xì)胞代謝密切相關(guān)；生物信息學(xué)分析表明，這些基因編碼的蛋白參與了脂類代謝、氨基酸代謝、碳源代謝以及TCA循環(huán)等(圖3B)。這說(shuō)明米黃色脂肪細(xì)胞與脂肪前體細(xì)胞代謝上存在明顯差異，也再次表明本實(shí)驗(yàn)中采用的誘導(dǎo)方法，可以使脂肪前體細(xì)胞分化為米黃色脂肪細(xì)胞。

A：差異表達(dá)基因的Volcano-plot分布圖；B：差異表達(dá)基因KEGG pathway分析。圖3 分化前后3T3-L1差異基因分析

3 討論

肥胖伴隨的各種并發(fā)癥，如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病，甚至腫瘤，嚴(yán)重影響著人類健康[12-14]。研究肥胖發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)預(yù)防和治療肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生將具有重要意義。

機(jī)體中棕色脂肪細(xì)胞和米黃色脂肪細(xì)胞均可高表達(dá)解耦連蛋白Ucp1，能夠?qū)⒒瘜W(xué)能轉(zhuǎn)變成熱能耗散掉，增加機(jī)體棕色脂肪和米黃色脂肪比例理論上能夠增加能量消耗，減少能源物質(zhì)堆積，防止肥胖發(fā)生。由于人體中棕色脂肪只存在于嬰幼兒時(shí)期，而米黃色脂肪伴隨終生，因此本研究通過(guò)地塞米松、IBMX、羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸、吲哚美辛和胰島素誘導(dǎo)分化以及羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸和胰島素的維持分化，最終可將脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的米黃色脂肪細(xì)胞。油紅染色結(jié)果表明，分化成熟的米黃色脂肪細(xì)胞中含有多個(gè)小脂滴，這與已有的研究報(bào)道結(jié)果一致[15]。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，分化后的細(xì)胞中米黃色脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白Ucp1、Pparγ和Prdm16的表達(dá)相比于未分化的脂肪前體細(xì)胞明顯上調(diào)，表明此法可以將脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為米黃色脂肪細(xì)胞。

米黃色脂肪細(xì)胞主要存在于白色脂肪組織中，與白色脂肪細(xì)胞來(lái)源相同，它們的分化均受Pparγ調(diào)控，成熟的米黃色脂肪細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞胞內(nèi)都含有脂滴。本研究中，判斷分化成熟的脂肪細(xì)胞是否是米黃色脂肪細(xì)胞時(shí)，不僅觀察了脂滴的存在形式和Pparγ的表達(dá)，同時(shí)也檢測(cè)了米黃色脂肪細(xì)胞功能蛋白Ucp1和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Prdm16的表達(dá)。在觀察到胞內(nèi)存在多個(gè)小脂滴且Ucp1、Pparγ、Prdm16表達(dá)均顯著上調(diào)的情況下，判定分化后的脂肪細(xì)胞為米黃色脂肪細(xì)胞。

3T3-L1細(xì)胞系經(jīng)誘導(dǎo)分化為米黃色脂肪細(xì)胞后，整體基因表達(dá)發(fā)生非常明顯的變化。首先，其基礎(chǔ)代謝狀態(tài)發(fā)生改變，KEGG pathway分析表明參與脂肪酸合成和降解代謝的基因出現(xiàn)明顯的富集，表明分化后的脂肪酸的合成和降解均比較活躍，這是脂肪細(xì)胞基本的代謝特征[16]。此外，氨基酸代謝，如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸以及碳源的代謝也呈現(xiàn)明顯富集。值得注意的是，Ppar信號(hào)途徑在米黃色脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中也出現(xiàn)明顯的富集，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說(shuō)明本研究中建立的米黃色脂肪細(xì)胞分化方法是成功的。差異表達(dá)基因中除包括上述參與各種代謝的基因外，還有許多轉(zhuǎn)錄因子也呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)，如zf-C2H2、Homeobox、ARID、COE、RHD等家族的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子的上下調(diào)將從基因表達(dá)調(diào)控的層面激活米黃色脂肪細(xì)胞代謝及行使功能所需的基因，并抑制與米黃色脂肪細(xì)胞無(wú)關(guān)基因的表達(dá)。

米黃色脂肪能夠高表達(dá)Ucp1，將機(jī)體積累的能源物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，是機(jī)體重要的代謝調(diào)控者，通過(guò)人為干預(yù)，控制機(jī)體中米黃色脂肪細(xì)胞的含量，來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)的能源物質(zhì)水平，特別是脂類的含量，將是改善肥胖所致的代謝紊亂及引起的各種并發(fā)癥的有效手段。但是由于目前人們對(duì)米黃色脂肪細(xì)胞形成的過(guò)程和機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺，因此以米黃色脂肪細(xì)胞為靶點(diǎn)的防治肥胖的手段尚未建立。本研究建立了體外誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞向米黃色脂肪細(xì)胞分化的方法，并對(duì)未分化和分化后的細(xì)胞進(jìn)行了初步的轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析，更深入的分析及機(jī)制研究將揭示米黃色脂肪細(xì)胞形成的機(jī)制，也將為以米黃色脂肪細(xì)胞為靶點(diǎn)的防治肥胖藥物的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。