吳 濤 周 俊 陳 震 張秋麗 晉 晶 付秋霞 詹林盛

在應(yīng)急條件或野戰(zhàn)情況下，創(chuàng)傷后失血增加，是引發(fā)傷者死亡的主要原因之一。在創(chuàng)傷失血后的最佳救治時(shí)間內(nèi)，懸浮紅細(xì)胞(red blood cells，RBCs)輸注顯得尤為必要和迫切。此外，在創(chuàng)傷后失血常伴隨全身嚴(yán)重炎癥，在救治過程中，懸浮RBCs輸注也仍然是一種重要的救治手段。而儲(chǔ)存RBCs的輸注在這種情況下也不可避免，其輸注能促進(jìn)創(chuàng)傷后炎癥、加重感染，進(jìn)一步引發(fā)膿毒血癥、導(dǎo)致感染性并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其具體作用機(jī)制尚不明確[1-3]。因此，要解決儲(chǔ)存RBCs輸注誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥及增強(qiáng)感染這一臨床問題，加強(qiáng)其致病機(jī)制的研究，必須尋找一種可靠的技術(shù)對(duì)動(dòng)物感染模型進(jìn)行觀察和研究。本研究采用活體熒光成像儀，利用小動(dòng)物分子影像技術(shù)監(jiān)測小鼠輸注儲(chǔ)存紅細(xì)胞對(duì)細(xì)菌感染的作用過程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠60只，均為雄性，6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并于無特定病原體(specific pathogen free，SPF)飼養(yǎng)間進(jìn)行飼養(yǎng)。

在60只小鼠中，進(jìn)行細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)的小鼠分為4組，每組5只；鐵(Fe)及Fe抑制劑小鼠分為4組，每組5只；進(jìn)行小鼠存活率實(shí)驗(yàn)的小鼠分為2組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

肺炎克雷伯菌Xen39菌株，大腸桿菌Xen5菌株，銅綠假單胞菌Xen13菌株，均由PerkinElmer公司贈(zèng)送。

1.3 儀器設(shè)備

IVIS 50型活體熒光成像儀(美國Caliper公司)；HEMAVET 950血常規(guī)測定儀(美國Mascot公司)；3K15臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；THZ-C型恒溫振蕩器(江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；PurecellNeo過濾器(美國Pall公司)。

1.4 試劑及材料

右旋糖酐鐵(iron dextran，批號(hào)SLBJ6731V)，右旋糖酐(dextran，批號(hào)SLBL 9703V)，CPDA抗凝劑(批號(hào)SLBK2844V)，血紅蛋白檢測試劑盒(批號(hào)BF03A26V)，均來自美國Sigma公司；戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)160714)；異氟烷(山東科源制藥有限公司，批號(hào)64160301)。

1.5 懸浮RBCs的制備

C57BL/6小鼠注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。通過心臟穿刺，無菌采血到檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺嘌呤(CPDA)-1抗凝劑中。用于儲(chǔ)存的最終CPDA-1濃度為14%。將來自20～40只小鼠的全血混合。使用新生兒白細(xì)胞去除過濾器進(jìn)行全血的白細(xì)胞去除。去除白細(xì)胞的全血，以3000 r/min離心15 min。去除上層的血漿，并將體積減少至最終的血紅蛋白濃度為16～19 g/dl。將RBCs(約15 ml)置于50 ml的Falcon管中，并在4 ℃下儲(chǔ)存長達(dá)14 d。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

1.6.1 RBCs輸血和細(xì)菌感染

小鼠分4組，每組5只。用小鼠固定器固定小鼠，用乙醇溶液對(duì)鼠尾進(jìn)行消毒。用注射器吸取準(zhǔn)備好的細(xì)菌溶液。選擇進(jìn)針點(diǎn)，注射器針頭穿刺入尾靜脈，向前推進(jìn)約2～3 mm。通過尾靜脈注射細(xì)菌200 μl感染每只實(shí)驗(yàn)小鼠。RBCs懸浮液稀釋調(diào)整至血紅蛋白濃度為17.0～17.5 g/dl。將400 μlRBCs懸浮液(相當(dāng)于2單位的人RBCs)通過異氟烷麻醉小鼠的眼后靜脈叢輸注。注射結(jié)束后將小鼠放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.6.2 小動(dòng)物活體成像

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入氣體麻醉箱中，打開麻醉氣體開關(guān)，用1%～3%異氟烷麻醉。待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物停止活動(dòng)后，將其放入活體成像儀中，打開麻醉氣體開關(guān)，并保持1%～2%的異氟烷持續(xù)麻醉。根據(jù)注射細(xì)菌數(shù)量不同，選取自動(dòng)活體成像模式，1～5 min不等，成像結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放回動(dòng)物飼養(yǎng)箱中。

1.6.3 Fe及Fe抑制劑注射

300 mg葡聚糖溶于3 ml的水中，THZ-C恒溫振蕩器振蕩16～18 h。細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，以2%的菌量接種于100 ml培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，待其菌液D值為0.5左右。將菌液轉(zhuǎn)移至50ml滅菌離心管中，4 ℃，4000 r/min離心15 min。棄上清，加入5 ml培養(yǎng)基后，用槍吹打均勻。小鼠氣管插管，注射50 μl肺炎克雷伯菌菌液，存活小鼠分2組，每組5只，第2組注射40 μl右旋糖酐鐵。小鼠于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h和24 h用成像儀成像。小鼠分4組，每組5只，第2組、第4組注射40 μl右旋糖酐鐵。第1組、第2組腹腔注射100 μl大腸桿菌菌液，第3組、第4組尾靜脈注射100 μl銅綠假單胞菌菌液。小鼠于0 h、0.5 h、1 h、4 h、4.5 h、5 h、6 h、8 h、12 h和24 h用成像儀成像。

1.6.4 小鼠存活率實(shí)驗(yàn)

將20只小鼠分為2組，每組10只。各組分別通過尾靜脈注射不同濃度的細(xì)菌200 μl，感染實(shí)驗(yàn)小鼠。同時(shí)通過小鼠的眼后靜脈叢輸注RBCs懸浮液400 μl。注射后24 h觀察每組小鼠的存活數(shù)量，計(jì)算小鼠存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)，采用t檢驗(yàn)。多組間進(jìn)行比較時(shí)若組間方差齊時(shí)，采用單因素多水平設(shè)計(jì)定量資料方差分析(ANOVA)；組間方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物發(fā)光成像

小動(dòng)物活體成像的生物發(fā)光成像顯示，用儲(chǔ)存RBCs輸注的小鼠中，感染后第1個(gè)24 h的生物發(fā)光通量的曲線下面積顯著增加(＞50%)。數(shù)據(jù)表明，輸入儲(chǔ)存的RBCs可以加重膿毒血癥并降低銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率(如圖1所示)。

圖1 活體熒光成像監(jiān)測RBCs輸注對(duì)銅綠假單胞菌在小鼠體內(nèi)增殖狀態(tài)的影響示圖

2.2 Fe促進(jìn)大腸桿菌及銅綠假單胞菌增殖

(1)RBCs代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量游離的Fe+，F(xiàn)e+能夠被細(xì)菌攝取，從而促進(jìn)細(xì)菌繁殖，因此，本研究觀察了Fe對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌繁殖的影響，其研究發(fā)現(xiàn)：Fe可以促進(jìn)大腸桿菌增殖。加Fe的一組細(xì)菌在8 h增殖達(dá)到峰值，12 h全部死亡(如圖2所示)。

圖2 Fe促進(jìn)大腸桿菌增殖示圖

(2)Fe可以促進(jìn)銅綠假單胞菌增殖，4 h開始，兩組有明顯差異(如圖3所示)。

圖3 Fe促進(jìn)銅綠假單胞菌增殖示圖

2.3 小鼠存活率

研究儲(chǔ)存RBCs輸注對(duì)銅綠假單胞菌誘導(dǎo)膿毒血癥的作用，使用2×107cfu的銅綠假單胞菌和400 μl新鮮或儲(chǔ)存RBCs靜脈內(nèi)注射給小鼠。本研究發(fā)現(xiàn)用儲(chǔ)存RBCs輸注小鼠的存活率顯著低于輸注新鮮RBCs小鼠的存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.835，P＜0.05)，如圖4所示。

圖4儲(chǔ)存的RBCs輸注降低銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率示圖

3 討論

應(yīng)急及特殊環(huán)境下發(fā)生感染的創(chuàng)傷患者具有較差的微循環(huán)功能和組織氧合能力，器官易于受到損傷，更易引發(fā)膿毒血癥，病死率較高。已有研究表明，儲(chǔ)存RBCs的輸注加重革蘭陰性細(xì)菌的感染，且游離血紅素在創(chuàng)傷出血中增加儲(chǔ)存RBCs的毒性，誘導(dǎo)急性器官損傷或引起嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的死亡[4-5]。應(yīng)急或野戰(zhàn)條件下的創(chuàng)傷失血患者，經(jīng)常導(dǎo)致炎癥相關(guān)的晚期并發(fā)癥，由于急性創(chuàng)傷破壞皮膚的保護(hù)屏障并抑制免疫系統(tǒng)，使得患者易受細(xì)菌感染。一旦細(xì)菌在傷口定植，可在受損組織內(nèi)快速增殖，經(jīng)常導(dǎo)致彌散性感染，由于感染進(jìn)行性加重，可以導(dǎo)致菌血癥和膿毒血癥、嚴(yán)重膿毒血癥及膿毒性休克等臨床癥狀，引發(fā)全身炎癥、患者發(fā)熱或體溫過低、白細(xì)胞增多或白細(xì)胞減少、心動(dòng)過速、呼吸急促或分鐘通氣量超常，具有高病死率[6-8]。嚴(yán)重膿毒血癥和膿毒性休克的患者，常常經(jīng)歷“血液學(xué)衰竭”：血細(xì)胞系和復(fù)雜的凝血和(或)抗血栓形成蛋白異常，出現(xiàn)貧血、血小板減少、白細(xì)胞減少、彌散性血管內(nèi)凝血和凝血因子的功能缺陷[9-10]。在膿毒血癥患者中，血管內(nèi)血容量不足是典型且嚴(yán)重的癥狀，需要快速、準(zhǔn)確及大劑量輸注液體進(jìn)行復(fù)蘇。膿毒血癥及膿毒性休克患者循環(huán)治療的主要措施是采用液體及血管加壓藥物來復(fù)蘇，用于保持最佳的器官灌注狀態(tài)。此外，血管加壓素是治療嚴(yán)重膿毒血癥和膿毒血癥休克的二線藥物，對(duì)于盡管有足夠的液體復(fù)蘇仍然低血壓或進(jìn)展為心源性肺水腫的患者有效。在應(yīng)急及特殊環(huán)境下，由于儲(chǔ)存及運(yùn)輸條件的限制，儲(chǔ)存RBCs的輸注就不可避免。

儲(chǔ)存RBCs輸注存在增加感染性疾病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，這主要與懸浮RBCs在儲(chǔ)存過程中引發(fā)的RBCs特性的改變有關(guān)[11-14]。RBCs儲(chǔ)存期間會(huì)發(fā)生顯著的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)和代謝變化，伴隨著潛在的有害生物活性產(chǎn)物的釋放，這些變化被稱為“儲(chǔ)存損傷”[5]。在儲(chǔ)存期間，RBCs的形態(tài)由于氧化損傷、生化變化和微泡化而逐漸出現(xiàn)RBCs形態(tài)的改變。在小鼠、犬及人類中的研究結(jié)果顯示，輸注儲(chǔ)存損傷的RBCs被單核吞噬細(xì)胞迅速從循環(huán)中清除，同時(shí)血紅蛋白迅速分解代謝，相關(guān)的鐵以一定的速度返回到血漿，超過轉(zhuǎn)鐵蛋白(生理鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)攝取的速率，從而產(chǎn)生循環(huán)的非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵，促進(jìn)了細(xì)菌的生長[4]。

因此，為解決儲(chǔ)存RBCs輸注誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥及增強(qiáng)感染這一臨床問題，必須選取合適的動(dòng)物模型及可靠的監(jiān)測技術(shù)對(duì)動(dòng)物的細(xì)菌感染情況進(jìn)行監(jiān)測。如今，生物發(fā)光成像正在成為一種對(duì)活體動(dòng)物治療效果進(jìn)行量化的有效技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是[15-16]：所需動(dòng)物數(shù)量少；可在同一動(dòng)物中監(jiān)測疾病的過程；跟蹤識(shí)別病原體傳播途徑。

生物發(fā)光細(xì)菌僅由活細(xì)菌產(chǎn)生，在不添加底物或滅活細(xì)菌的情況下檢測生物發(fā)光信號(hào)，使得其成為用于實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)菌和高通量生物技術(shù)的理想報(bào)告物。本研究探討儲(chǔ)存RBCs輸注對(duì)細(xì)菌感染小鼠的作用，在小鼠靜脈內(nèi)同時(shí)輸注新鮮或儲(chǔ)存RBCs及銅綠假單胞菌，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存RBCs輸注促進(jìn)了銅綠假單胞菌在感染小鼠體內(nèi)的增殖，降低了小鼠的存活率。