劉華棟,李婷婷,唐 娟,陸冰洋,丁樹(shù)榮,王彩先*
(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山西太原 030032)
新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種烈性傳染病,該病具有發(fā)病急、死亡快、死亡率高等特征[1]。本病是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)的最嚴(yán)重疾病之一[2]。而且不同NDV 毒株的毒力差別很大[3]。新城疫防控使用的疫苗和免疫程序都已經(jīng)成熟,但在臨床上仍然發(fā)病,而且流行很?chē)?yán)重,成為最難以防治的疾病之一[4]。新城疫發(fā)病越來(lái)越早,甚至在胚胎中可以檢測(cè)出不同毒力的病毒[5、6],初生的雛雞就會(huì)發(fā)病,表現(xiàn)出ND 的癥狀和病變。本研究采取雞胚接種的方式進(jìn)行免疫,孵出后的雛雞能檢測(cè)到抗體,且不會(huì)造成雞胚的死亡,可以為養(yǎng)殖場(chǎng)防控本病提供參考。
病料采自山西地區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)。發(fā)病雞使用咽肛拭子采集病料,將棉簽用滅菌生理鹽水浸濕后分別在雞的喉頭、氣管和泄殖腔內(nèi)輕觸后將其置于1.5 mL 的離心管中,加入滅菌的50%的甘油生理鹽水,做好標(biāo)記。剖檢病雞后,無(wú)菌取其肝臟、脾臟、肺臟等器官置于無(wú)菌的一次性封口袋中,做好標(biāo)記。采集的樣本在放置冰袋的保溫盒中保存,帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-20℃的冰箱保存。
1 日齡、6 周齡齡的雛雞,均由SPF 蛋孵化,在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。
新城疫病毒通用型RT-PCR 檢測(cè)試劑盒(北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司),RNA 提取試劑盒(北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司);M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒(BS249),Dream-Taq DNA 聚合酶、Marker、6×DNA Loading Dye(生工生物工程<上海>股份有限公司);PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒(生工生物工程<上海>股份有限公司SK1131);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒(TaKaRa);蔗糖、瓊脂糖、瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、阿氏液(生工生物工程<上海>股份有限公司);SPF 蛋(北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司)。引物序列合成和基因測(cè)序(生工生物工程<上海>股份有限公司)。鮮血瓊脂培養(yǎng)基,購(gòu)自青島日水科技有限公司。
取病死雞的肺臟、肝臟、脾臟等器官混合后稱取1 g,用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g 于研磨器中研磨,加入1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中,8,000 rpm 離心2 min,取上清液100 μL 于1.5 mL 滅菌離心管中。病毒RNA 提取、擴(kuò)增參照新城疫病毒通用型RT-PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),按照步驟操作進(jìn)行。
將病死雞腦組織通過(guò)反復(fù)凍融3 次,研磨,按1:5 加入滅菌生理鹽水,加入雙抗(5,000 U(μg)/mL)37 ℃感作1 h,3,000 rpm 離心30 min,取上清液。使用一次性無(wú)菌注射器抽取上清液,去掉針頭,與濾膜過(guò)濾器連接,通過(guò)使用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后,將濾液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
取100 μL 濾液分別接種于馬丁肉湯、血液瓊脂平板、厭氧肉肝湯和沙氏斜面,37 ℃培養(yǎng)96 h,觀察結(jié)果。
取無(wú)菌上清液,尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚10 枚,接種滅菌生理鹽水2 枚作為陰性對(duì)照,0.2 mL/枚,37 ℃孵育,棄去24 h 內(nèi)死亡的雞胚,每日照蛋兩次,收集死亡胚中尿囊液,至96 h 收凍未死雞胚,無(wú)菌收集雞胚尿囊液,-20 ℃保存?zhèn)溆?,并觀察雞胚病變。
1.6.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的F 基因序列,使用軟件Primer Premier 設(shè)計(jì)一對(duì)引物,用于擴(kuò)增F 基因94~457 區(qū)段363 bp。F-F:5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3';F-R:5'-GGAGGATGT T GGCAGCAT-3'。
1.6.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
1.6.3 PCR 反應(yīng)PCR 加樣方式為:10×DreamTaq Buffer 10 μL,dNTP(10 mM)6 μL,Template 20 μL,Taq 酶(5U/μl)0.5 μL,MgCl26 μL,上下游引物各2 μL(25 pmol/μL),超純水加至100 μL,進(jìn)行RCR 擴(kuò)增。
PCR 反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,進(jìn)行35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,結(jié)束反應(yīng)。取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,切取陽(yáng)性目的片段用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。
序列比對(duì)、同源性分析、親緣樹(shù)構(gòu)建使用軟件為DNAStar,DNAMAN。
對(duì)所分離到的病毒的毒力測(cè)定,主要測(cè)定其MDT、IVPI、ICPI三個(gè)指數(shù)。測(cè)定方法用OIE 標(biāo)準(zhǔn)[7]操作。
取2 周齡非免疫雛雞10 只,接種前采血進(jìn)行HI 試驗(yàn),結(jié)果為陰性,通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼的方式接種病毒,滴入第三代雞胚尿囊液,對(duì)照組滴入生理鹽水,滴入量為0.1 mL/只。分離病毒株攻毒5 只雞,對(duì)照組5 只雞。隔離飼養(yǎng),觀察兩周,記錄發(fā)病情況,從發(fā)病雞中分離病毒進(jìn)行PCR 鑒定。
應(yīng)用血凝試驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)病毒的效價(jià)。血凝試驗(yàn)參照國(guó)標(biāo)GB/T 14926.53—2001 操作。
取40 枚18 日齡的SPF 蛋,在氣室中接種病毒,接種方法為:將收集的雞胚尿囊液用0.9%生理鹽水進(jìn)行稀釋,選用稀釋后抗體效價(jià)為21、22、23、24的稀釋液備用。將SPF 雞胚消毒后,在其氣室部位的中央的蛋殼上打孔,而后將注射器針頭經(jīng)孔向卵中心方向刺進(jìn),大約10 mm 深時(shí)將稀釋液注入,每枚蛋注入0.2 mL,用石蠟封孔后置于孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵化,前72 h 不翻蛋。另取10 枚SPF 蛋作為對(duì)照,待雛雞出殼后24 h,通過(guò)心臟采血,應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)其血清中的抗體效價(jià)。
由圖1 可見(jiàn),病料擴(kuò)增出362 bp 的特異性條帶,與陽(yáng)性對(duì)照條帶一致。
病毒接種雞胚后,死亡的雞胚在頭頸部甚至周身都有出血情況。尿囊液渾濁。
由圖2 可見(jiàn),擴(kuò)增出大小為363 bp 的特異性條帶。
從測(cè)序結(jié)果已知,分離株的112~117 位的氨基酸順序?yàn)镚RQGRL,與標(biāo)準(zhǔn)的弱毒株的順序相同。101 位氨基酸為R,121 位氨基酸為I,與弱毒株相同。表明分離株為弱毒株。同源性比較和親緣關(guān)系比較見(jiàn)表1 和圖3。
由表1 可知NDV 山西分離株SX-2 與Clone30、La Sota 和VG/GA 株的同源性最高,均達(dá)到96%以上,與Clone30 和La Sota 株的同源性相同,同為最高,達(dá)到97.8%。
由圖3可見(jiàn),NDV分離株SX-2 與Clone30、La Sota 和VG/GA 株同處于同一個(gè)大的分枝,親緣關(guān)系最近。
表1 NDV 分離株和國(guó)內(nèi)外毒株同源性比較
通過(guò)對(duì)分離病毒的MDT、IVPI、ICPI 等三個(gè)指數(shù)的測(cè)定,結(jié)果MDT 為92.5,IVPI 為0.2,ICPI 為0。
雞在攻毒后第4 天表現(xiàn)為精神萎靡,食欲不振,有的雞拉黃綠色稀便,無(wú)死亡。剖檢病雞,可見(jiàn)腺胃乳頭有少量點(diǎn)狀出血,腺胃和肌胃交界處也見(jiàn)有少量出血點(diǎn)。十二指腸有散在的出血點(diǎn),雙側(cè)盲腸扁桃體均出血。采集內(nèi)臟組織進(jìn)行PCR 鑒定,均能夠出現(xiàn)特異性條帶。
通過(guò)對(duì)病毒采用血凝試驗(yàn)檢測(cè),其病毒效價(jià)為25。
由表2 可知,孵出后1 日齡的雛雞血液中可以檢測(cè)到ND 抗體,而對(duì)照組均無(wú)抗體。表明這種方法可行。當(dāng)病毒效價(jià)高于22時(shí),雞胚就會(huì)出現(xiàn)死亡情況。所以選用病毒效價(jià)為22作為免疫效價(jià)。
表2 NDV雞胚免疫后雛雞效價(jià)表
本次從山西省雞場(chǎng)采集病料,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行PCR 鑒定,擴(kuò)增出262 bp 的條帶。對(duì)病原通過(guò)雞胚尿囊腔內(nèi)的培養(yǎng)和擴(kuò)增病毒,擴(kuò)增其毒力相關(guān)的F 基因,擴(kuò)增出263 bp 的條帶。測(cè)序后將序列同國(guó)內(nèi)外已知序列進(jìn)行比對(duì),可見(jiàn)分離病毒從基因上顯示為弱毒株,為基因Ⅱ型。對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)毒力測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)MDT 為92.5,IVPI 為0.2,ICPI 為0 也證明了分離株為弱毒株。通過(guò)回歸試驗(yàn)表明分離病毒具有明顯的致病性,確定其為野毒株,并非疫苗株。說(shuō)明本地區(qū)存在新城疫弱毒株的感染,只是不易被發(fā)現(xiàn)。
國(guó)內(nèi)對(duì)雞胚進(jìn)行免疫的研究早在1984 年[8],最初是用來(lái)接種馬立克氏病毒疫苗,并獲得成功。國(guó)外已經(jīng)應(yīng)用本方法來(lái)免疫馬立克氏病[9]。王振國(guó)[10]等在1986 年開(kāi)始研究用此方法預(yù)防新城疫,通過(guò)在蛋內(nèi)接種NDV 疫苗,研究不同日齡的雞胚和不同稀釋度的疫苗在不同部位接種后的對(duì)孵化率和免疫效果的影響。結(jié)果表明在18-19 日齡接種最好,接種部位是以氣室和卵黃囊部位最好,并指出接種部位與接種病毒濃度具有相關(guān)性。朱堯生[11]表明雞胚發(fā)育到第18 天,其免疫系統(tǒng)已基本建立,能夠?qū)δ承┛乖a(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答,而且可以避開(kāi)母源抗體的干擾[9]。后來(lái)彭遠(yuǎn)義[12]、艾國(guó)良[13]等人分別進(jìn)行了雞胚接種的研究,表明在18 日齡接種為最佳,接種部位為氣室。本研究也是針對(duì)18 日齡的雞胚進(jìn)行免疫接種,選擇氣室作為接種部位,通過(guò)試驗(yàn)篩選出合理的接種病毒效價(jià)。雛雞具有較高的抗體效價(jià)水平,而且生長(zhǎng)發(fā)育良好。
目前國(guó)內(nèi)的研究所使用的雞胚均為普通雞胚,本身就帶有母源抗體,雖然抗體的干擾較小,但并不能排除干擾,而本研究使用的是SPF 雞胚,不含有ND 母源抗體,能更好的說(shuō)明初生雛雞的抗體是由免疫產(chǎn)生的。
之前的研究均使用NDV 疫苗進(jìn)行雞胚的免疫,而本研究首次使用本地分離株進(jìn)行試驗(yàn),取得了良好的免疫效果。說(shuō)明養(yǎng)雞場(chǎng)可以使用本場(chǎng)的分離株進(jìn)行雞胚免疫,更有針對(duì)性的防控ND。