劉華棟，李婷婷，唐 娟，陸冰洋，丁樹榮，王彩先*

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種烈性傳染病，該病具有發(fā)病急、死亡快、死亡率高等特征[1]。本病是危害我國養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)的最嚴重疾病之一[2]。而且不同NDV 毒株的毒力差別很大[3]。新城疫防控使用的疫苗和免疫程序都已經(jīng)成熟，但在臨床上仍然發(fā)病，而且流行很嚴重，成為最難以防治的疾病之一[4]。新城疫發(fā)病越來越早，甚至在胚胎中可以檢測出不同毒力的病毒[5、6]，初生的雛雞就會發(fā)病，表現(xiàn)出ND 的癥狀和病變。本研究采取雞胚接種的方式進行免疫，孵出后的雛雞能檢測到抗體，且不會造成雞胚的死亡，可以為養(yǎng)殖場防控本病提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料

病料采自山西地區(qū)某養(yǎng)雞場。發(fā)病雞使用咽肛拭子采集病料，將棉簽用滅菌生理鹽水浸濕后分別在雞的喉頭、氣管和泄殖腔內(nèi)輕觸后將其置于1.5 mL 的離心管中，加入滅菌的50%的甘油生理鹽水，做好標記。剖檢病雞后，無菌取其肝臟、脾臟、肺臟等器官置于無菌的一次性封口袋中，做好標記。采集的樣本在放置冰袋的保溫盒中保存，帶回實驗室后置于-20℃的冰箱保存。

1.2 試驗動物

1 日齡、6 周齡齡的雛雞，均由SPF 蛋孵化，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗動物房飼養(yǎng)。

1.3 試劑

新城疫病毒通用型RT-PCR 檢測試劑盒（北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司），RNA 提取試劑盒（北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司）；M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒（BS249），Dream-Taq DNA 聚合酶、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工生物工程＜上海＞股份有限公司SK1131）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）；蔗糖、瓊脂糖、瓊脂粉、營養(yǎng)瓊脂、阿氏液（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；SPF 蛋（北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司）。引物序列合成和基因測序（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）。鮮血瓊脂培養(yǎng)基，購自青島日水科技有限公司。

1.4 PCR 鑒定

取病死雞的肺臟、肝臟、脾臟等器官混合后稱取1 g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g 于研磨器中研磨，加入1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中，8,000 rpm 離心2 min，取上清液100 μL 于1.5 mL 滅菌離心管中。病毒RNA 提取、擴增參照新城疫病毒通用型RT-PCR 檢測試劑盒說明書，按照步驟操作進行。

1.5 病毒的分離培養(yǎng)

將病死雞腦組織通過反復(fù)凍融3 次，研磨，按1：5 加入滅菌生理鹽水，加入雙抗（5,000 U（μg）/mL）37 ℃感作1 h，3,000 rpm 離心30 min，取上清液。使用一次性無菌注射器抽取上清液，去掉針頭，與濾膜過濾器連接，通過使用0.22 μm 的濾膜過濾后，將濾液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取100 μL 濾液分別接種于馬丁肉湯、血液瓊脂平板、厭氧肉肝湯和沙氏斜面，37 ℃培養(yǎng)96 h，觀察結(jié)果。

取無菌上清液，尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚10 枚，接種滅菌生理鹽水2 枚作為陰性對照，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，棄去24 h 內(nèi)死亡的雞胚，每日照蛋兩次，收集死亡胚中尿囊液，至96 h 收凍未死雞胚，無菌收集雞胚尿囊液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫⒂^察雞胚病變。

1.6 基因毒力測定

1.6.1 引物設(shè)計 根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的F 基因序列，使用軟件Primer Premier 設(shè)計一對引物，用于擴增F 基因94～457 區(qū)段363 bp。F-F：5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3'；F-R：5'-GGAGGATGT T GGCAGCAT-3'。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書操作。

1.6.3 PCR 反應(yīng)PCR 加樣方式為：10×DreamTaq Buffer 10 μL，dNTP（10 mM）6 μL，Template 20 μL，Taq 酶（5U/μl）0.5 μL，MgCl26 μL，上下游引物各2 μL（25 pmol/μL），超純水加至100 μL，進行RCR 擴增。

PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進行35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。取PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切取陽性目的片段用膠回收試劑盒進行回收。

1.7 序列分析

序列比對、同源性分析、親緣樹構(gòu)建使用軟件為DNAStar，DNAMAN。

1.8 生物學(xué)毒力測定

對所分離到的病毒的毒力測定，主要測定其MDT、IVPI、ICPI三個指數(shù)。測定方法用OIE 標準[7]操作。

1.9 動物回歸試驗

取2 周齡非免疫雛雞10 只，接種前采血進行HI 試驗，結(jié)果為陰性，通過滴鼻點眼的方式接種病毒，滴入第三代雞胚尿囊液，對照組滴入生理鹽水，滴入量為0.1 mL/只。分離病毒株攻毒5 只雞，對照組5 只雞。隔離飼養(yǎng)，觀察兩周，記錄發(fā)病情況，從發(fā)病雞中分離病毒進行PCR 鑒定。

1.10 病毒效價檢測

應(yīng)用血凝試驗檢測培養(yǎng)病毒的效價。血凝試驗參照國標GB/T 14926.53—2001 操作。

1.11 雞胚免疫

取40 枚18 日齡的SPF 蛋，在氣室中接種病毒，接種方法為：將收集的雞胚尿囊液用0.9%生理鹽水進行稀釋，選用稀釋后抗體效價為21、22、23、24的稀釋液備用。將SPF 雞胚消毒后，在其氣室部位的中央的蛋殼上打孔，而后將注射器針頭經(jīng)孔向卵中心方向刺進，大約10 mm 深時將稀釋液注入，每枚蛋注入0.2 mL，用石蠟封孔后置于孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵化，前72 h 不翻蛋。另取10 枚SPF 蛋作為對照，待雛雞出殼后24 h，通過心臟采血，應(yīng)用血凝抑制試驗檢測其血清中的抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 PCR 鑒定結(jié)果

由圖1 可見，病料擴增出362 bp 的特異性條帶，與陽性對照條帶一致。

2.2 分離鑒定結(jié)果

病毒接種雞胚后，死亡的雞胚在頭頸部甚至周身都有出血情況。尿囊液渾濁。

2.3 基因毒力測定結(jié)果

由圖2 可見，擴增出大小為363 bp 的特異性條帶。

2.4 序列分析結(jié)果

從測序結(jié)果已知，分離株的112～117 位的氨基酸順序為GRQGRL，與標準的弱毒株的順序相同。101 位氨基酸為R，121 位氨基酸為I，與弱毒株相同。表明分離株為弱毒株。同源性比較和親緣關(guān)系比較見表1 和圖3。

由表1 可知NDV 山西分離株SX-2 與Clone30、La Sota 和VG/GA 株的同源性最高，均達到96%以上，與Clone30 和La Sota 株的同源性相同，同為最高，達到97.8%。

由圖3可見，NDV分離株SX-2 與Clone30、La Sota 和VG/GA 株同處于同一個大的分枝，親緣關(guān)系最近。

2.5 生物學(xué)毒力測定結(jié)果

表1 NDV 分離株和國內(nèi)外毒株同源性比較

通過對分離病毒的MDT、IVPI、ICPI 等三個指數(shù)的測定，結(jié)果MDT 為92.5，IVPI 為0.2，ICPI 為0。

2.6 動物回歸試驗結(jié)果

雞在攻毒后第4 天表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振，有的雞拉黃綠色稀便，無死亡。剖檢病雞，可見腺胃乳頭有少量點狀出血，腺胃和肌胃交界處也見有少量出血點。十二指腸有散在的出血點，雙側(cè)盲腸扁桃體均出血。采集內(nèi)臟組織進行PCR 鑒定，均能夠出現(xiàn)特異性條帶。

2.6 病毒效價檢測結(jié)果

通過對病毒采用血凝試驗檢測，其病毒效價為25。

2.7 雞胚免疫結(jié)果

由表2 可知，孵出后1 日齡的雛雞血液中可以檢測到ND 抗體，而對照組均無抗體。表明這種方法可行。當病毒效價高于22時，雞胚就會出現(xiàn)死亡情況。所以選用病毒效價為22作為免疫效價。

表2 NDV雞胚免疫后雛雞效價表

3 討論

本次從山西省雞場采集病料，通過對其進行PCR 鑒定，擴增出262 bp 的條帶。對病原通過雞胚尿囊腔內(nèi)的培養(yǎng)和擴增病毒，擴增其毒力相關(guān)的F 基因，擴增出263 bp 的條帶。測序后將序列同國內(nèi)外已知序列進行比對，可見分離病毒從基因上顯示為弱毒株，為基因Ⅱ型。對其進行生物學(xué)毒力測定，結(jié)果見MDT 為92.5，IVPI 為0.2，ICPI 為0 也證明了分離株為弱毒株。通過回歸試驗表明分離病毒具有明顯的致病性，確定其為野毒株，并非疫苗株。說明本地區(qū)存在新城疫弱毒株的感染，只是不易被發(fā)現(xiàn)。

國內(nèi)對雞胚進行免疫的研究早在1984 年[8]，最初是用來接種馬立克氏病毒疫苗，并獲得成功。國外已經(jīng)應(yīng)用本方法來免疫馬立克氏病[9]。王振國[10]等在1986 年開始研究用此方法預(yù)防新城疫，通過在蛋內(nèi)接種NDV 疫苗，研究不同日齡的雞胚和不同稀釋度的疫苗在不同部位接種后的對孵化率和免疫效果的影響。結(jié)果表明在18-19 日齡接種最好，接種部位是以氣室和卵黃囊部位最好，并指出接種部位與接種病毒濃度具有相關(guān)性。朱堯生[11]表明雞胚發(fā)育到第18 天，其免疫系統(tǒng)已基本建立，能夠?qū)δ承┛乖a(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，而且可以避開母源抗體的干擾[9]。后來彭遠義[12]、艾國良[13]等人分別進行了雞胚接種的研究，表明在18 日齡接種為最佳，接種部位為氣室。本研究也是針對18 日齡的雞胚進行免疫接種，選擇氣室作為接種部位，通過試驗篩選出合理的接種病毒效價。雛雞具有較高的抗體效價水平，而且生長發(fā)育良好。

目前國內(nèi)的研究所使用的雞胚均為普通雞胚，本身就帶有母源抗體，雖然抗體的干擾較小，但并不能排除干擾，而本研究使用的是SPF 雞胚，不含有ND 母源抗體，能更好的說明初生雛雞的抗體是由免疫產(chǎn)生的。

之前的研究均使用NDV 疫苗進行雞胚的免疫，而本研究首次使用本地分離株進行試驗，取得了良好的免疫效果。說明養(yǎng)雞場可以使用本場的分離株進行雞胚免疫，更有針對性的防控ND。