劉華棟，李婷婷，唐 娟，陸冰洋，丁樹(shù)榮，王彩先*

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種烈性傳染病，該病具有發(fā)病急、死亡快、死亡率高等特征[1]。本病是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)的最嚴(yán)重疾病之一[2]。而且不同NDV 毒株的毒力差別很大[3]。新城疫防控使用的疫苗和免疫程序都已經(jīng)成熟，但在臨床上仍然發(fā)病，而且流行很嚴(yán)重，成為最難以防治的疾病之一[4]。新城疫發(fā)病越來(lái)越早，甚至在胚胎中可以檢測(cè)出不同毒力的病毒[5、6]，初生的雛雞就會(huì)發(fā)病，表現(xiàn)出ND 的癥狀和病變。本研究采取雞胚接種的方式進(jìn)行免疫，孵出后的雛雞能檢測(cè)到抗體，且不會(huì)造成雞胚的死亡，可以為養(yǎng)殖場(chǎng)防控本病提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料

病料采自山西地區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)。發(fā)病雞使用咽肛拭子采集病料，將棉簽用滅菌生理鹽水浸濕后分別在雞的喉頭、氣管和泄殖腔內(nèi)輕觸后將其置于1.5 mL 的離心管中，加入滅菌的50%的甘油生理鹽水，做好標(biāo)記。剖檢病雞后，無(wú)菌取其肝臟、脾臟、肺臟等器官置于無(wú)菌的一次性封口袋中，做好標(biāo)記。采集的樣本在放置冰袋的保溫盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-20℃的冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

1 日齡、6 周齡齡的雛雞，均由SPF 蛋孵化，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.3 試劑

新城疫病毒通用型RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司），RNA 提取試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）；M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒（BS249），Dream-Taq DNA 聚合酶、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工生物工程＜上海＞股份有限公司SK1131）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）；蔗糖、瓊脂糖、瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、阿氏液（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；SPF 蛋（北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司）。引物序列合成和基因測(cè)序（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）。鮮血瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自青島日水科技有限公司。

1.4 PCR 鑒定

取病死雞的肺臟、肝臟、脾臟等器官混合后稱取1 g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g 于研磨器中研磨，加入1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中，8,000 rpm 離心2 min，取上清液100 μL 于1.5 mL 滅菌離心管中。病毒RNA 提取、擴(kuò)增參照新城疫病毒通用型RT-PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，按照步驟操作進(jìn)行。

1.5 病毒的分離培養(yǎng)

將病死雞腦組織通過(guò)反復(fù)凍融3 次，研磨，按1：5 加入滅菌生理鹽水，加入雙抗（5,000 U（μg）/mL）37 ℃感作1 h，3,000 rpm 離心30 min，取上清液。使用一次性無(wú)菌注射器抽取上清液，去掉針頭，與濾膜過(guò)濾器連接，通過(guò)使用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后，將濾液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取100 μL 濾液分別接種于馬丁肉湯、血液瓊脂平板、厭氧肉肝湯和沙氏斜面，37 ℃培養(yǎng)96 h，觀察結(jié)果。

取無(wú)菌上清液，尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚10 枚，接種滅菌生理鹽水2 枚作為陰性對(duì)照，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，棄去24 h 內(nèi)死亡的雞胚，每日照蛋兩次，收集死亡胚中尿囊液，至96 h 收凍未死雞胚，無(wú)菌收集雞胚尿囊液，-20 ℃保存?zhèn)溆?，并觀察雞胚病變。

1.6 基因毒力測(cè)定

1.6.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的F 基因序列，使用軟件Primer Premier 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增F 基因94～457 區(qū)段363 bp。F-F：5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3'；F-R：5'-GGAGGATGT T GGCAGCAT-3'。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6.3 PCR 反應(yīng)PCR 加樣方式為：10×DreamTaq Buffer 10 μL，dNTP（10 mM）6 μL，Template 20 μL，Taq 酶（5U/μl）0.5 μL，MgCl26 μL，上下游引物各2 μL（25 pmol/μL），超純水加至100 μL，進(jìn)行RCR 擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切取陽(yáng)性目的片段用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.7 序列分析

序列比對(duì)、同源性分析、親緣樹(shù)構(gòu)建使用軟件為DNAStar，DNAMAN。

1.8 生物學(xué)毒力測(cè)定

對(duì)所分離到的病毒的毒力測(cè)定，主要測(cè)定其MDT、IVPI、ICPI三個(gè)指數(shù)。測(cè)定方法用OIE 標(biāo)準(zhǔn)[7]操作。

1.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取2 周齡非免疫雛雞10 只，接種前采血進(jìn)行HI 試驗(yàn)，結(jié)果為陰性，通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼的方式接種病毒，滴入第三代雞胚尿囊液，對(duì)照組滴入生理鹽水，滴入量為0.1 mL/只。分離病毒株攻毒5 只雞，對(duì)照組5 只雞。隔離飼養(yǎng)，觀察兩周，記錄發(fā)病情況，從發(fā)病雞中分離病毒進(jìn)行PCR 鑒定。

1.10 病毒效價(jià)檢測(cè)

應(yīng)用血凝試驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)病毒的效價(jià)。血凝試驗(yàn)參照國(guó)標(biāo)GB/T 14926.53—2001 操作。

1.11 雞胚免疫

取40 枚18 日齡的SPF 蛋，在氣室中接種病毒，接種方法為：將收集的雞胚尿囊液用0.9%生理鹽水進(jìn)行稀釋，選用稀釋后抗體效價(jià)為21、22、23、24的稀釋液備用。將SPF 雞胚消毒后，在其氣室部位的中央的蛋殼上打孔，而后將注射器針頭經(jīng)孔向卵中心方向刺進(jìn)，大約10 mm 深時(shí)將稀釋液注入，每枚蛋注入0.2 mL，用石蠟封孔后置于孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵化，前72 h 不翻蛋。另取10 枚SPF 蛋作為對(duì)照，待雛雞出殼后24 h，通過(guò)心臟采血，應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)其血清中的抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 PCR 鑒定結(jié)果

由圖1 可見(jiàn)，病料擴(kuò)增出362 bp 的特異性條帶，與陽(yáng)性對(duì)照條帶一致。

2.2 分離鑒定結(jié)果

病毒接種雞胚后，死亡的雞胚在頭頸部甚至周身都有出血情況。尿囊液渾濁。

2.3 基因毒力測(cè)定結(jié)果

由圖2 可見(jiàn)，擴(kuò)增出大小為363 bp 的特異性條帶。

2.4 序列分析結(jié)果

從測(cè)序結(jié)果已知，分離株的112～117 位的氨基酸順序?yàn)镚RQGRL，與標(biāo)準(zhǔn)的弱毒株的順序相同。101 位氨基酸為R，121 位氨基酸為I，與弱毒株相同。表明分離株為弱毒株。同源性比較和親緣關(guān)系比較見(jiàn)表1 和圖3。

由表1 可知NDV 山西分離株SX-2 與Clone30、La Sota 和VG/GA 株的同源性最高，均達(dá)到96%以上，與Clone30 和La Sota 株的同源性相同，同為最高，達(dá)到97.8%。

由圖3可見(jiàn)，NDV分離株SX-2 與Clone30、La Sota 和VG/GA 株同處于同一個(gè)大的分枝，親緣關(guān)系最近。

2.5 生物學(xué)毒力測(cè)定結(jié)果

表1 NDV 分離株和國(guó)內(nèi)外毒株同源性比較

通過(guò)對(duì)分離病毒的MDT、IVPI、ICPI 等三個(gè)指數(shù)的測(cè)定，結(jié)果MDT 為92.5，IVPI 為0.2，ICPI 為0。

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

雞在攻毒后第4 天表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振，有的雞拉黃綠色稀便，無(wú)死亡。剖檢病雞，可見(jiàn)腺胃乳頭有少量點(diǎn)狀出血，腺胃和肌胃交界處也見(jiàn)有少量出血點(diǎn)。十二指腸有散在的出血點(diǎn)，雙側(cè)盲腸扁桃體均出血。采集內(nèi)臟組織進(jìn)行PCR 鑒定，均能夠出現(xiàn)特異性條帶。

2.6 病毒效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)病毒采用血凝試驗(yàn)檢測(cè)，其病毒效價(jià)為25。

2.7 雞胚免疫結(jié)果

由表2 可知，孵出后1 日齡的雛雞血液中可以檢測(cè)到ND 抗體，而對(duì)照組均無(wú)抗體。表明這種方法可行。當(dāng)病毒效價(jià)高于22時(shí)，雞胚就會(huì)出現(xiàn)死亡情況。所以選用病毒效價(jià)為22作為免疫效價(jià)。

表2 NDV雞胚免疫后雛雞效價(jià)表

3 討論

本次從山西省雞場(chǎng)采集病料，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行PCR 鑒定，擴(kuò)增出262 bp 的條帶。對(duì)病原通過(guò)雞胚尿囊腔內(nèi)的培養(yǎng)和擴(kuò)增病毒，擴(kuò)增其毒力相關(guān)的F 基因，擴(kuò)增出263 bp 的條帶。測(cè)序后將序列同國(guó)內(nèi)外已知序列進(jìn)行比對(duì)，可見(jiàn)分離病毒從基因上顯示為弱毒株，為基因Ⅱ型。對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)毒力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)MDT 為92.5，IVPI 為0.2，ICPI 為0 也證明了分離株為弱毒株。通過(guò)回歸試驗(yàn)表明分離病毒具有明顯的致病性，確定其為野毒株，并非疫苗株。說(shuō)明本地區(qū)存在新城疫弱毒株的感染，只是不易被發(fā)現(xiàn)。

國(guó)內(nèi)對(duì)雞胚進(jìn)行免疫的研究早在1984 年[8]，最初是用來(lái)接種馬立克氏病毒疫苗，并獲得成功。國(guó)外已經(jīng)應(yīng)用本方法來(lái)免疫馬立克氏病[9]。王振國(guó)[10]等在1986 年開(kāi)始研究用此方法預(yù)防新城疫，通過(guò)在蛋內(nèi)接種NDV 疫苗，研究不同日齡的雞胚和不同稀釋度的疫苗在不同部位接種后的對(duì)孵化率和免疫效果的影響。結(jié)果表明在18-19 日齡接種最好，接種部位是以氣室和卵黃囊部位最好，并指出接種部位與接種病毒濃度具有相關(guān)性。朱堯生[11]表明雞胚發(fā)育到第18 天，其免疫系統(tǒng)已基本建立，能夠?qū)δ承┛乖a(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，而且可以避開(kāi)母源抗體的干擾[9]。后來(lái)彭遠(yuǎn)義[12]、艾國(guó)良[13]等人分別進(jìn)行了雞胚接種的研究，表明在18 日齡接種為最佳，接種部位為氣室。本研究也是針對(duì)18 日齡的雞胚進(jìn)行免疫接種，選擇氣室作為接種部位，通過(guò)試驗(yàn)篩選出合理的接種病毒效價(jià)。雛雞具有較高的抗體效價(jià)水平，而且生長(zhǎng)發(fā)育良好。

目前國(guó)內(nèi)的研究所使用的雞胚均為普通雞胚，本身就帶有母源抗體，雖然抗體的干擾較小，但并不能排除干擾，而本研究使用的是SPF 雞胚，不含有ND 母源抗體，能更好的說(shuō)明初生雛雞的抗體是由免疫產(chǎn)生的。

之前的研究均使用NDV 疫苗進(jìn)行雞胚的免疫，而本研究首次使用本地分離株進(jìn)行試驗(yàn)，取得了良好的免疫效果。說(shuō)明養(yǎng)雞場(chǎng)可以使用本場(chǎng)的分離株進(jìn)行雞胚免疫，更有針對(duì)性的防控ND。