陳子菁，張振宇，姚宏亮，楊勇勝，李靜，馮美琴，顏玉華*

（1.金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院南京 210038；2.金陵科技學(xué)院理學(xué)院南京 211169）

黃秋葵（Okra,Hibiscus esculentus L.）又叫羊角豆、補(bǔ)腎草、洋辣椒，屬于食藥雙用的新型蔬菜[1]。其嫩果肉質(zhì)潤滑、營養(yǎng)爽口，具有特殊香氣和風(fēng)味，既可生食，也可煮食、炒食、油炸等。黃秋葵營養(yǎng)價(jià)值高，它不但含有豐富的多糖（屬于碳水化合物）、膳食纖維，而且各類維生素與礦物元素含量也高于同類蔬菜[2]，對人具有較好的藥用保健功能[3]，同時(shí)也是良好的動(dòng)物飼料來源，可提高動(dòng)物營養(yǎng)[4]。

近年來的一系列研究表明，黃秋葵的多種生物活性與其水提液中的多糖密切相關(guān)。黃秋葵分枝嫩果、幼葉、花朵中都富含多糖，其具有補(bǔ)腎、減肥、補(bǔ)鈣、增強(qiáng)抵抗力[5]、防癌、防貧血、美容[6]等功效。在動(dòng)物保健領(lǐng)域，黃秋葵的功能特性也正逐漸被挖掘，劉國道等[7]發(fā)現(xiàn)，將黃秋葵粉定量加入肉雞的復(fù)合飼料后，可顯著提高肉雞脂肪和皮膚的著色效果；張海文等[8]研究顯示，在日糧中添加黃秋葵粗多糖粉，可有效改善儋州雞的生長與屠宰性能，提高消化酶活性及雞肉品質(zhì)，以及提升儋州雞的免疫器官指數(shù)和增強(qiáng)抗氧化能力[9]。黃秋葵多糖還能顯著降低小鼠血糖[10]、抗疲勞[11]、改善胃腸動(dòng)力[12]，Sabitha 等[13]的研究也有相似的發(fā)現(xiàn)。張忠堤[14]利用其自制的黃秋葵汁液（配芝麻油），治療各類人與動(dòng)物的燒（燙）傷近100 例，效果顯著。

傳統(tǒng)工藝條件下，黃秋葵多糖提取得率低下。如何高效地從黃秋葵中提取多糖，促進(jìn)黃秋葵的綜合利用，近年來已成為專業(yè)人員研究的熱點(diǎn)。本文旨在通過水提溫度、水提時(shí)間、液料比、水提次數(shù)四個(gè)不同的單因素，篩選出對熱水浸提黃秋葵多糖提取率影響顯著的試驗(yàn)因子及其中心點(diǎn)，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，最后得到優(yōu)化后的最佳實(shí)際工藝，為黃秋葵多糖更廣范圍內(nèi)的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵新鮮嫩果：購于南京市棲霞區(qū)彩虹廣場蘇果超市。無水乙醇，以上試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2010 電子天平，上海舜宇科學(xué)儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海鑫翁科學(xué)儀器公司；JM-100 低溫高速離心機(jī)，BAKEMAN 公司；Laborota-400 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph 公司；Alpha 1-2 型冷凍干燥機(jī)，英國LABCONCO 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃秋葵多糖提取的工藝流程黃秋葵嫩果，嚴(yán)格剔除腐爛果、老果，粉碎后，恒溫干燥制備黃秋葵干粉，并研磨成細(xì)粉。準(zhǔn)確稱取一定量的黃秋葵細(xì)干粉，加入適量的水，恒溫加熱一定的時(shí)間，冷卻后離心去渣，上清液經(jīng)旋蒸濃縮去除掉大部分水分，再加入3 倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀。通過不斷攪拌，其中的黃秋葵多糖陸續(xù)沉淀，置于4℃的冰箱中冷藏過夜，隔日進(jìn)行過濾處理，得到黃秋葵粗多糖，最后再進(jìn)行凍干處理，備用。

1.3.2 黃秋葵多糖提取率的計(jì)算

提取率（%）=（黃秋葵粗多糖重量/黃秋葵干粉重量）× 100%

1.3.3 多糖提取條件的優(yōu)化以黃秋葵多糖提取率作為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了4 組單因素試驗(yàn)，即水提溫度、水提時(shí)間、液料比、水提次數(shù)。在單因素試驗(yàn)所得結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用RSM（響應(yīng)曲面法）中的BBD 中心組合設(shè)計(jì)，采用3 因素3 水平方案，研究各單因素組合對多糖提取得率的影響，并繪出響應(yīng)面圖及對應(yīng)的等高線圖，最終實(shí)現(xiàn)提取工藝的優(yōu)化，從而提高多糖得率。

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 水提溫度對多糖提取率的影響由圖1 可知，當(dāng)水提時(shí)間為60min，液料比為70：1（mL/g），提取次數(shù)為1 次時(shí)，隨著水提溫度的升高，多糖提取率也在慢慢提升，70℃時(shí)達(dá)到最大值（27.8%）；當(dāng)加熱溫度大于70℃時(shí)，多糖的提取得率卻有所降低，也許是偏高的提取溫度致使部分大分子多糖水解成小分子低聚糖或單糖，且能耗增加。因此，水提溫度設(shè)定為70℃上下。

2.1.2 水提時(shí)間對多糖提取率的影響由圖2 可知，當(dāng)水提溫度為70℃，液料比為70：1（mL/g），提取次數(shù)為1 次時(shí)，水提時(shí)間逐漸延長的同時(shí)，也伴隨著多糖提取得率的緩慢提升，當(dāng)時(shí)間升至約60min 時(shí)，多糖提取得率不再繼續(xù)增加，其達(dá)到最大值（約28.4%）。隨著水提時(shí)間的進(jìn)一步延長，多糖的提取得率卻不增反降，任丹丹等[15]認(rèn)為如果水提時(shí)間過長，必然引起多糖的長分子鏈產(chǎn)生裂解，形成了小分子的寡糖，甚至單糖。因此，水提時(shí)間設(shè)定在60min 左右。

2.1.3 液料比對多糖提取率的影響由圖3 可知，當(dāng)水提溫度為70℃，水提時(shí)間為60min，提取次數(shù)為1 次時(shí)，隨著液料比的一次次增大，多糖的提取得率也在一步步提升，因?yàn)樗嵋赫吵矶仍降?，植物?xì)胞壁中釋放出的多糖就越多。當(dāng)液料比達(dá)到并超過70∶1（mL/g）時(shí)，所得多糖的增量明顯放緩，考慮到后期水提液旋蒸濃縮時(shí)能量及時(shí)間的消耗，因此，液料比確定為70∶1（mL/g）。

2.1.4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響由圖4 可知，當(dāng)水提溫度為70℃，水提時(shí)間為60min，液料比為70∶1（mL/g）時(shí)，若提取次數(shù)僅為1 次，多糖的提取得率高達(dá)25.1%，第二次對離心渣重復(fù)水提時(shí)，多糖得率僅為3.7%，依次重復(fù)操作，單次提取得率顯著減少，第五次時(shí)幾乎為0。為了提高試驗(yàn)效率，降低能源浪費(fèi)，水提次數(shù)只進(jìn)行1 次。

2.2 響應(yīng)面分析及黃秋葵多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 模型擬合及統(tǒng)計(jì)分析在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出水提溫度、水提時(shí)間以及液料比這3 個(gè)自變量，以多糖得率為因變量，采用響應(yīng)面法（response surface method,RSM）的Box-Behnken design（BBD）試驗(yàn)，進(jìn)行3 因素3 水平下的中心組合設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素、編碼與水平

BBD 試驗(yàn)分組方案及結(jié)果見表2，整個(gè)模型一共分為17 組，每組各3 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。多糖得率從27.35%～28.41%不等。

通過Design-Expert V9.1 軟件對表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到關(guān)于黃秋葵多糖提取率對自變量水提溫度（A）、水提時(shí)間（B）、液料比（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 響應(yīng)面分析的方案與結(jié)果

Y=28.30+0.073A+0.011B+0.034C+0.097AB-0.011AC+0.24BC-0.10A2-0.57B2-0.099C2

Design-Expert V9.1 軟件得到的方差分析結(jié)果見表3。

從表3 可以看出，該模型F 值（87.10）較高，P 值（＜0.0001）較低，表明模型極顯著，該試驗(yàn)方法可靠；決定系數(shù)R2=0.9908，表明該模型的試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值之間的一致性非常良好；調(diào)整系數(shù)R2adj=0.9785，表明多糖提取率中高達(dá)97.85%的變異由獨(dú)立變量決定，只有2.15%的總變異不能通過該模型解釋；失擬項(xiàng)P 值（0.3286）＞0.05，不顯著，說明該模型方程能較好地對多糖的提取得率進(jìn)行準(zhǔn)確、有效的預(yù)測，結(jié)果可信度高。

表3 方差分析

由表3 可知，B2、BC 都是極顯著水平（P＜0.001），說明它們對響應(yīng)值（多糖提取率）影響極大，其余變量的影響都不顯著（P＞0.05）。依據(jù)響應(yīng)面分析的結(jié)果，對黃秋葵多糖提取得率的影響依次為：水提溫度（A）＞液料比（C）＞水提時(shí)間（B）。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖與等高線圖分析自變量A、B、C 值對應(yīng)于響應(yīng)值（多糖提取率）構(gòu)成的3D 響應(yīng)曲面圖以及在2D 平面上的等高線圖，可直觀地反映出各因素相互之間的作用。當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)，表明兩因素之間交互作用不顯著；而當(dāng)?shù)雀呔€呈橢圓形時(shí)，表明兩因素之間交互作用顯著。由Design-Expert V9.1 軟件處理得到響應(yīng)面分析結(jié)果見圖5—7。

由圖5—7 可知，只有水提時(shí)間與液料比之間的交互作用是顯著的（等高線呈橢圓形），其它的兩兩交互作用都是不明顯的（等高線不呈橢圓形），這與表3 的結(jié)果是相符合的。

由回歸模型可知，黃秋葵多糖提取的最佳工藝如下：水提溫度為69.38℃，水提時(shí)間為58.37min，液料比為71.21∶1（mL/g），在此條件下，黃秋葵多糖的提取率可達(dá)28.26%。結(jié)合實(shí)際情況綜合考慮，將最佳理論工藝條件進(jìn)行調(diào)整：水提溫度為70℃，水提時(shí)間為58min，液料比為71∶1（mL/g）。條件調(diào)整后，通過3 次平行試驗(yàn)，測得黃秋葵多糖最大提取率的均值是27.87%，與理論值比較相近。所以，通過響應(yīng)曲面法得到的工藝優(yōu)化條件是可信的，適合對黃秋葵多糖提取率進(jìn)行預(yù)測。

3 結(jié)論

本項(xiàng)目對黃秋葵多糖的“水提醇沉”工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì)法優(yōu)化多糖提取工藝參數(shù)。黃秋葵多糖最佳提取條件為：水提時(shí)間為58min，水提溫度為70℃，液料比為71∶1（mL/g），在此條件下，黃秋葵多糖實(shí)際最大提取得率為27.87%。