， ， ， ，

(1. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心， 上海200082； 2. 上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 上海200444)

生物堿是煙草品質(zhì)的最重要化學(xué)指標(biāo)，主要包括尼古丁以及其他微量生物堿，如降煙堿、新煙草堿和假木賊堿等。煙草生物堿的含量與組成將直接影響煙草的抽吸特征及質(zhì)量安全[1]，是影響煙葉品質(zhì)的重要因素。尼古丁含量是評價(jià)煙葉品質(zhì)的決定性因素，約占煙草生物堿總量的95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以下同)以上[2]， 是煙草化學(xué)常規(guī)檢測的重要指標(biāo)之一。 煙草中微量生物堿的含量與卷煙質(zhì)量安全息息相關(guān)，一般要求其含量小于煙草生物堿總量的6%[3]。在煙草調(diào)制中， 降煙堿、 假木賊堿和新煙草堿可轉(zhuǎn)化成煙草特有亞硝胺(TSNA)[2]， TSNA被認(rèn)為是卷煙中活性最強(qiáng)、 含量最大的致癌成分， 嚴(yán)重危害卷煙質(zhì)量安全。 煙草植株中， 個別植株由于基因突變會形成煙堿轉(zhuǎn)化基因， 具備了煙堿去甲基能力， 因此導(dǎo)致尼古丁含量減小， 降煙堿含量顯著增大， 這一類降煙堿含量大于生物堿總量5%的植株被稱為轉(zhuǎn)化株[4]。 轉(zhuǎn)化株降煙堿含量過大， 會嚴(yán)重影響卷煙品質(zhì)和質(zhì)量安全， 在煙草生產(chǎn)活動中需要加以辨別和清除。 快速、 準(zhǔn)確、 定量檢測煙草中生物堿含量與組成，對煙葉質(zhì)量評價(jià)、 提升卷煙質(zhì)量安全具有重要意義。

近紅外光譜(NIR)技術(shù)具有無損、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于我國煙草行業(yè)[5]。目前近紅外在煙草中的應(yīng)用研究主要針對烤后煙葉的常規(guī)檢測指標(biāo)，較少針對烤前青煙葉及其他微量指標(biāo)[6-10]。 本文中應(yīng)用傅里葉變換近紅外漫反射光譜(FT-NIR)技術(shù)， 建立青煙葉及烤煙葉中4種生物堿(尼古丁、 降煙堿、 新煙草堿、 假木賊堿)的近紅外數(shù)學(xué)定量模型， 實(shí)現(xiàn)對煙草中微量生物堿的準(zhǔn)確、 快速定量檢測； 分別對比轉(zhuǎn)化株及非轉(zhuǎn)化株烤前青煙葉及烤煙葉樣品的4種生物堿含量， 分析轉(zhuǎn)化株煙葉烘烤調(diào)制過程中的煙堿轉(zhuǎn)化， 有助于研究煙草生物堿的代謝與轉(zhuǎn)化途徑， 可輔助深入研究其轉(zhuǎn)化代謝機(jī)理， 為煙草生長過程中煙葉品質(zhì)的調(diào)控提供指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器及軟件

近紅外光譜儀型號為AntarisⅡFT-NIR，配備積分球漫反射采樣系統(tǒng)，Thermo Fisher公司生產(chǎn)。

近紅外光譜數(shù)據(jù)處理軟件為OMNIC，光譜分析化學(xué)計(jì)量學(xué)建模軟件為TQ Analyst。

1.2 樣品

青煙葉樣品123份，青煙葉采摘后經(jīng)干冰冷凍方式運(yùn)輸后，在液氮下粉碎、磨粉、整理，于-80 ℃超低溫冰箱中保存以備用。測試前，需要將樣品取出放于干燥皿中，靜置24 h至室溫，然后進(jìn)行近紅外光譜掃描。

烤煙葉樣品412份，其中包含123份青煙葉的對應(yīng)烤后樣品。

1.3 光譜采集

環(huán)境溫度為20～24 ℃，相對濕度為55%～65%，近紅外光譜掃描范圍為4 000～10 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，掃描64次，取平均值。

1.4 樣品化學(xué)值測量

采用氣相色譜- 氫火焰離子化檢測器(GC - FID)的方法進(jìn)行4種生物堿化學(xué)值的定量檢測。

1)配置工作曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，對煙草樣品堿化處理后用甲叔醚溶液過夜萃取，然后進(jìn)行分析。

2)GC - FID條件。細(xì)管柱，DB - 5(30 m×0.32 mm×1 μm)； 進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為He，恒流，體積流量為1.7 mL/min；程序升溫：110 ℃下保持5 min，然后以10 ℃/min的速率升至185 ℃，再以6 ℃/min的速率升至250 ℃保持10 min；FID檢測器溫度為300 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜處理

基于青煙葉樣品及烤煙葉樣品的化學(xué)實(shí)測值與近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行建模及驗(yàn)證，對近紅外光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理，Norris平滑(段長5，段間距5)，采用偏最小二乘(PLS)法建立4種生物堿化學(xué)含量與近紅外光譜的數(shù)學(xué)模型，并進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 模型評價(jià)

考察所建模型校正集與驗(yàn)證集的相關(guān)系數(shù)r，以交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)、預(yù)測均方差(SEP)和校正均方差(SEC)的比值、驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)與SEP的比值作為評價(jià)模型優(yōu)劣的指標(biāo)，當(dāng)r大于0.9，SEP與SEC的比值介于0.8～1.2，SD與SEP的比值大于2.0時(shí)，所建模型預(yù)測效果較好[11]。

2.3 異常值剔除

1)通過殘差分析剔除化學(xué)值與預(yù)測值差別較大的樣品，即離群值[12]；

2)通過學(xué)生化殘差(殘差與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的比值)分析，剔除化學(xué)值異常的樣品。

2.4 近紅外定量分析模型的建立與驗(yàn)證

2.4.1 尼古丁

分別建立青煙葉、烤煙葉樣品的尼古丁含量與近紅外光譜的定量分析模型，青煙葉建模106個樣品，獨(dú)立驗(yàn)證11個樣品，剔除6個異常值，交叉驗(yàn)證預(yù)測27個樣品；烤煙葉建模373個樣品，獨(dú)立驗(yàn)證37個樣品，剔除2個異常值，交叉驗(yàn)證預(yù)測187個樣品。校正集及驗(yàn)證集的r、RMSECV、SEP與SEC的比值、SD與SEP的比值以及含量范圍如表1所示，尼古丁含量預(yù)測值與實(shí)測值的散點(diǎn)圖見圖1。

表1 青煙葉及烤煙葉中尼古丁含量近紅外數(shù)學(xué)模型評價(jià)結(jié)果

(a)青煙葉(b)烤煙葉圖1 青煙葉、烤煙葉中尼古丁含量預(yù)測值與實(shí)測值散點(diǎn)圖

2.4.2 降煙堿

分別建立青煙葉、 烤煙葉樣品的降煙堿含量與近紅外光譜的定量分析模型， 青煙葉建模101個樣品， 獨(dú)立驗(yàn)證14個樣品， 剔除8個異常值， 交叉驗(yàn)證預(yù)測26個樣品； 烤煙葉建模352個樣品， 預(yù)測37個樣品， 剔除23個異常值， 交叉驗(yàn)證預(yù)測192個樣品。 校正集及驗(yàn)證集的r、 RMSECV、 SEP與SEC的比值、 SD與SEP的比值以及含量范圍如表2所示， 降煙堿含量預(yù)測值與實(shí)測值的散點(diǎn)圖見圖2。

表2 青煙葉及烤煙葉中降煙堿含量近紅外數(shù)學(xué)模型評價(jià)結(jié)果

(a)青煙葉(b)烤煙葉圖2 青煙葉、烤煙葉中降煙堿預(yù)測值與實(shí)測值散點(diǎn)圖

由圖2可以看出， 青煙葉及烤煙葉樣品中， 降煙堿含量高的樣品數(shù)量較少， 絕大多數(shù)樣品的降煙堿含量落在圖中較低水平且分布相對集中。 在模型建立過程中， 少數(shù)高含量樣品的存在會使模型強(qiáng)制過高點(diǎn)， 使模型發(fā)生偏離， 導(dǎo)致低含量樣本的預(yù)測值偏離化學(xué)值， 影響所建模型的準(zhǔn)確性?？紤]到煙草種植的實(shí)際情況以及日常檢測樣品的含量區(qū)間范圍， 去掉樣品中的轉(zhuǎn)化株樣品進(jìn)行二次建模， 可以根據(jù)實(shí)測情況應(yīng)用不同的降煙堿模型對降煙堿含量進(jìn)行預(yù)測， 以提高預(yù)測準(zhǔn)確性。 非轉(zhuǎn)化株樣品所建模型的評價(jià)結(jié)果及散點(diǎn)圖如表3和圖3所示。

表3 青煙葉及烤煙葉中降煙堿近紅外數(shù)學(xué)模型評價(jià)結(jié)果(非轉(zhuǎn)化株)

(a)青煙葉(b)烤煙葉圖3 青煙葉、烤煙葉中降煙堿含量預(yù)測值與實(shí)測值散點(diǎn)圖(非轉(zhuǎn)化株)

由表3、圖3中數(shù)據(jù)可以看出，去掉轉(zhuǎn)化株樣品后所建模型，青煙葉及烤煙葉數(shù)據(jù)模型各評價(jià)指標(biāo)變化不大，r值仍在0.90～0.95附近，且主因子數(shù)減小至10、6，SEP與SEC的比值為0.84、0.97，SD與SEP的比值均大于2.0，模型各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)均較好。在日常檢測中，針對非轉(zhuǎn)化株樣品，可應(yīng)用本模型進(jìn)行預(yù)測，以提高預(yù)測準(zhǔn)確性。

2.4.3 新煙草堿

分別建立青煙葉、 烤煙葉樣品的新煙草堿含量與近紅外光譜的定量分析模型， 青煙葉建模112個樣品， 預(yù)測7個樣品， 剔除4個異常值， 交叉驗(yàn)證預(yù)測28個樣品； 烤煙葉建模366個樣品，預(yù)測38個樣品， 剔除8個異常值， 交叉驗(yàn)證預(yù)測182個樣品。 校正集及驗(yàn)證集的r、 RMSECV、 SEP與SEC的比值、 SD與SEP的比值以及含量范圍如表4所示， 新煙草堿含量預(yù)測值與實(shí)測值的散點(diǎn)圖見圖4。

2.4.4 假木賊堿

分別建立青煙葉、 烤煙葉樣品的假木賊堿含量與近紅外光譜的定量分析模型， 青煙葉建模109個樣品， 預(yù)測8個樣品， 剔除6個異常值， 交叉驗(yàn)證預(yù)測28個樣品； 烤煙葉建模366個樣品， 預(yù)測37個樣品， 剔除9個異常值， 交叉驗(yàn)證預(yù)測178個樣品。 校正集及驗(yàn)證集的r、 RMSECV、 SEP與SEC的比值、 SD與SEP的比值以及含量范圍如表5所示， 假木賊堿含量預(yù)測值與實(shí)測值的散點(diǎn)圖見圖5。

2.5 青煙葉及烤煙葉生物堿含量分析

經(jīng)過2.4.2節(jié)中對降煙堿含量的考察結(jié)果可知，在本批樣品中包含部分轉(zhuǎn)化株煙草樣品，為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化株及非轉(zhuǎn)化株樣品烘烤調(diào)制前、后生物堿含量的變化，選取青煙葉及烤煙葉樣品中樣品植株信息相對應(yīng)的樣品共83份，進(jìn)行烤前、烤后生物堿含量的分析。以同一樣品烤后含量與烤前含量比值來表征烘烤調(diào)制過程生物堿含量的變化(見表6)。

表4 青煙葉及烤煙葉中新煙草堿含量近紅外數(shù)學(xué)模型評價(jià)結(jié)果

(a)青煙葉(b)烤煙葉圖4 青煙葉、烤煙葉中新煙草堿含量預(yù)測值與實(shí)測值散點(diǎn)圖

表5 青煙葉及烤煙葉中假木賊堿含量近紅外數(shù)學(xué)模型評價(jià)結(jié)果

(a)青煙葉(b)烤煙葉圖5 青煙葉、烤煙葉中假木賊堿含量預(yù)測值與實(shí)測值散點(diǎn)圖

表6 煙葉烘烤調(diào)制前、后生物堿含量的變化

由表6中可以看出，正常煙草非轉(zhuǎn)化植株，烘烤調(diào)制前、 后4種生物堿的含量基本不變。轉(zhuǎn)化株烘烤調(diào)制前、后新煙草堿、假木賊堿含量變化不大，尼古丁含量明顯減小，降煙堿含量顯著增大，這表明轉(zhuǎn)化株在烘烤調(diào)制過程中發(fā)生了尼古丁向降煙堿轉(zhuǎn)化的過程，從而導(dǎo)致尼古丁含量減小，降煙堿含量增大，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。這種轉(zhuǎn)化過程發(fā)生的原因如下：轉(zhuǎn)化株中含有煙堿轉(zhuǎn)化基因，可生成數(shù)量較多的高活性煙堿去甲基化酶，在烘烤調(diào)制初始階段，酶活性的提高促使了尼古丁向降煙堿的轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

1)青煙葉及烤煙葉樣品的近紅外數(shù)學(xué)模型各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)較好，預(yù)測值與實(shí)測值的r約為0.9，預(yù)測均方差與校正均方差比值均為0.8～1.2，驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測均方差比值均大于2.0，表明所建近紅外預(yù)測模型準(zhǔn)確、可靠，近紅外光譜技術(shù)可用于各類生物堿，包括微量生物堿的快速定量檢測。

2)正常非轉(zhuǎn)化株烘烤調(diào)制前、后4種生物堿含量變化不大，轉(zhuǎn)化株烘烤調(diào)制后尼古丁含量有所減小，降煙堿含量顯著增大，表明煙葉在烘烤調(diào)制階段發(fā)生了尼古丁轉(zhuǎn)化生成降煙堿的過程。