梁 詩(shī)，李 煊,,，陳良華，黃 雯，許傳俊，童慶宣,，林 毅，明艷林,,

(1.廈門(mén)華僑亞熱帶植物引種園/廈門(mén)市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361002；2.華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；3.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén)361006)

野菊Chrysanthemum indicum屬菊科多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū)，生于山坡草地、田邊、路旁等地帶[1]。野菊在我國(guó)已有兩千多年的藥用食用歷史，入藥最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)。其氣芳香，味苦、辛，性微寒，具清熱解毒、瀉火平肝的功效，用于治療疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈等[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，野菊提取物具有抗炎[4]、抗氧化[5—6]、抗腫瘤[7—8]、抗菌[9—10]、抗病毒[11]、保肝[12—13]等生物活性，其化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、萜類(lèi)、多糖、黃酮、綠原酸類(lèi)等[14]。野菊水提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷有明顯的保護(hù)效果，并能顯著下調(diào)細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)蛋白水平[15]。戴勝[12]對(duì)野菊花80%乙醇提取物保肝活性成分(急性肝損傷)進(jìn)行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)醇提物、乙酸乙酯層、正丁醇層均具有保肝活性。張曉雯等[16]發(fā)現(xiàn)，野菊醇提物具有抗氧化活性，其中總黃酮和總多酚對(duì)其抗氧化活性有較大貢獻(xiàn)。這些研究揭示了野菊提取物在抗氧化、保肝等方面具有良好的生物活性，但這些研究主要集中于野菊花的活性，對(duì)莖、葉的活性和可利用價(jià)值關(guān)注較少，相關(guān)研究主要集中于莖葉多糖及其抗氧化研究[17—18]。本文主要通過(guò)自由基清除實(shí)驗(yàn)及酒精性肝損傷細(xì)胞模型對(duì)野菊地上部分水和乙醇提取物的抗氧化活性及保肝效果進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野菊莖、葉采樣于廈門(mén)華僑亞熱帶植物引種園。HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH )，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，噻唑藍(lán)( MTT) 購(gòu)自 Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器包括Thermo MK3型酶標(biāo)儀、Thermo超低溫冰箱、EYELA N-1100S-W 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Christ Alpha 2-4 LD plus冷凍干燥機(jī)、Thermo二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、PerkinElmer Lambda25紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備 稱(chēng)取野菊干粉，分別用水和95%乙醇按料液比1:20 45℃超聲提取，抽濾收集濾液，減壓濃縮(45 ℃)至無(wú)醇味，得到野菊水提物和醇提物浸膏。取野菊水提物和醇提物浸膏于-80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍12 h后，轉(zhuǎn)至Christ冷凍干燥機(jī)凍干，得到野菊水提物和醇提物干燥粉末，密封保存于-20 ℃。

1.2.2 DPPH自由基清除測(cè)定 分別取2 mL不同濃度(50、100、200、400、800、1600 μg·mL-1)的野菊水提物、醇提物以及陽(yáng)性對(duì)照 V?(5、10、15、20、25、30 μg·mL-1)待測(cè)液，加入 2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH自由基溶液，搖勻，避光30 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai；將DPPH自由基溶液用等體積無(wú)水乙醇代替，其他同前，測(cè)吸光度Aj；將樣品用等體積無(wú)水乙醇代替，其他同前，測(cè)吸光度Ae。DPPH自由基清除率計(jì)算公式：K= [1-(Ai-Aj)/Ae]×100%。

1.2.3 ABTS自由基清除測(cè)定 取7.9 mg ABTS溶于10 mL蒸餾水中，另取1.3 mg過(guò)硫酸鉀溶于10 mL蒸餾水中，混合兩種溶液即得ABTS儲(chǔ)備液，室溫條件下避光儲(chǔ)存過(guò)夜，使用時(shí)稀釋4倍。分別取不同濃度野菊水提物(20、40、80、160、240 μg·mL-1)、醇提物(10、20、40、80、100、120 μg·mL-1)以及陽(yáng)性對(duì)照V?(2.5、5、10、15、25、30 μg·mL-1)樣品液和ABTS稀釋液等量混合，在734 nm處測(cè)吸光度值；將樣品液用等體積水代替，其他同前，測(cè)吸光度。ABTS自由基清除率計(jì)算公式：K′=[1-(Ai′-Ae′)/(Aj′-Ae′)]×100%，K′為清除率；Ai′為加試樣反應(yīng)后 ABTS 溶液的吸光度；Aj′為不加試樣溶液的吸光度；Ae′為不加ABTS溶液的吸光度。

1.2.4 細(xì)胞存活率測(cè)定 96孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞每孔3000個(gè)，37 ℃孵育24 h，分別加入不同濃度野菊水提物(終濃度 0、31.25、62.5、125、250、500 μg·mL-1)、醇提物(終濃度 0、8、16、32、64、128 μg·mL-1)藥液，37 ℃孵育 24 h 后，每孔加入 20 μL 5 mg·mL-1MTT 培養(yǎng)液，孵育 4 h，棄上清液，每孔加100 μL DMSO，震蕩20 min后，用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定吸光度值。

1.2.5 野菊水提物和醇提物對(duì)酒精刺激HepG2細(xì)胞存活率測(cè)定 參考羅燕梅等[19]方法，于96孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞每孔3000個(gè)，37 ℃孵育24 h，分別加入不同濃度(0、5、10、20 μg·mL-1)野菊水提物、醇提物藥液預(yù)處理24 h，各組加入終濃度800 mmol·L-1乙醇誘導(dǎo)損傷，正常對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，37 ℃孵育24 h，每孔加入 20 μL 5 mg·mL-1MTT培養(yǎng)液，孵育4 h，棄上清液，每孔加100 μL DMSO，震蕩20 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm吸光度值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野菊水提物和醇提物DPPH自由基清除能力

比較野菊水提物、醇提物與V? (陽(yáng)性對(duì)照)的DPPH自由基清除能力。結(jié)果表明，DPPH自由基清除能力為 V?＞野菊醇提物＞野菊水提物(圖 1)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，野菊提取物雖然具備一定的 DPPH自由基清除能力，但明顯偏弱，效果差10倍以上。V?、野菊水提物、野菊醇提物半效應(yīng)濃度(EC50)分別為 19.02 μg·mL-1、452.57 μg·mL-1、194.93 μg·mL-1(表 1)。

圖1 DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity

2.2 野菊水提物和醇提物ABTS自由基清除能力

評(píng)價(jià)野菊水提物、醇提物和 V?(陽(yáng)性對(duì)照)清除 ABTS自由基的能力。與清除DPPH自由基能力類(lèi)似，ABTS自由基清除能力大小依次為V?＞野菊醇提物＞野菊水提物，但野菊醇提物對(duì)ABTS自由基清除能力明顯優(yōu)于對(duì)DPPH自由基的清除能力(圖2)。V?、野菊水提物、野菊醇提物的EC50分別為 9.32、60.35、24.04 μg·mL-1(表 1)。

表1 野菊提取物自由基清除能力Table 1 Radical scavenging capacity of Chrysanthemum indicum extracts

圖2 ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity

2.3 野菊水提物和醇提物對(duì)酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的影響

采用HepG2細(xì)胞模型評(píng)價(jià)野菊水提物和醇提物對(duì)酒精肝損傷的保護(hù)效果，首先對(duì)野菊水提物和醇提物的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，野菊水提物在500 μg·mL-1劑量濃度內(nèi)對(duì)模型細(xì)胞株HepG2未呈現(xiàn)細(xì)胞毒性，野菊醇提物在64 μg·mL-1劑量濃度內(nèi)未呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，在128 μg·mL-1濃度下細(xì)胞活力下降至74.20%，呈現(xiàn)出低細(xì)胞毒性(圖3)。

圖3 野菊提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性Fig.3 Cytotoxicity of Chrysanthemum indicum extracts to HepG2

在對(duì)野菊水提物和醇提物細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，選擇無(wú)毒濃度5、10、20 μg·mL-1進(jìn)行酒精肝損傷保護(hù)效果評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，野菊提取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)效果(圖 4)。與對(duì)照組相比，模型組(eth)細(xì)胞存活率分別下降至28.96%和28.37%，而使用野菊水提物和醇提物處理的藥物濃度組細(xì)胞存活率顯著增加。在800 mmol·L-1酒精損傷情況下，與對(duì)照相比，野菊水提物5、10、20 μg·mL-1處理使細(xì)胞存活率分別提高 54.02%、76.86%、68.32%；野菊醇提物 5、10、20 μg·mL-1處理使細(xì)胞存活率分別提高48.79%、71.18%、76.14%。保護(hù)效果總體上呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。

圖4 野菊提取物對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of Chrysanthemum indicum extracts on alcoholic liver injury

3 討論

本文采用DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)野菊莖、葉水提物和醇提物的體外抗氧化能力，并通過(guò)體外HepG2細(xì)胞模型測(cè)定野菊水提物和醇提物對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，野菊提取物具備一定的抗氧化活性，其中醇提物的抗氧化效果明顯優(yōu)于水提物，說(shuō)明野菊中抗氧化成分主要集中于醇溶部位；野菊醇提物對(duì)ABTS自由基清除能力明顯高于對(duì)DPPH自由基的清除能力，與張曉雯等[16,20]對(duì)野菊提取物清除DPPH、ABTS自由基能力的研究結(jié)果相似。野菊總黃酮具有良好的抗氧化活性[21]，且野菊總黃酮醇提含量高于水提含量[22]。因此，野菊水提物和醇提物的抗氧化活性及其能力差別可能歸因于其中的黃酮類(lèi)成分。體外酒精肝損傷細(xì)胞模型的結(jié)果表明，野菊提取物顯著地提高了酒精誘導(dǎo)后肝細(xì)胞的存活率，在800 mmol·L-1乙醇損傷情況下，濃度為5～20 μg·mL-1的野菊水提物和醇提物均能使細(xì)胞存活率顯著或極顯著提高，且保肝效果總體上呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，其中醇提物的保肝效果更佳。在酒精性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化作用起著重要作用。野菊的保肝成分(酒精肝損傷)可能并不完全依賴(lài)其抗氧化性能，具體的保肝活性成分及保肝機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本文著重從體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ完U明野菊莖、葉提取物的抗氧化能力和保肝活性，為后續(xù)野菊中保肝活性成分篩選和野菊地上部分的開(kāi)發(fā)利用研究提供依據(jù)。