賴卓欣 劉 雅 王慶恒,2① 鄭 哲,2 鄧岳文,2

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心 湛江 524088)

由非碳水化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃倪^(guò)程稱為糖異生(Gluconeogenesis)，糖異生是增加葡萄糖產(chǎn)生的一個(gè)主要途徑(Cota-Ruizet al,2015)。果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)又稱果糖1,6-二磷酸酯酶，它催化果糖-1,6-二磷酸水解生成果糖-6-磷酸和無(wú)機(jī)磷，在糖的異生代謝過(guò)程中起關(guān)鍵性的作用(Lozinska-Gabskaet al,2003; Kaiseret al,1996)。FBP幾乎存在于所有生物體中，包括細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物，但不存在于有異源蛋白的古細(xì)菌中(Stecet al,2000)。已有研究表明，在高溫、干旱(Xiaoet al,2014; 曲玲等,2015)和缺氧(Cota-Ruizet al,2016)等非生物脅迫下，F(xiàn)BP通過(guò)參與催化動(dòng)植物體能量產(chǎn)生途徑產(chǎn)生更多的能量，在動(dòng)植物體度過(guò)不良環(huán)境過(guò)程中起著重要的作用。第一個(gè)被人們所知的FBP序列全長(zhǎng)是從小鼠(Rattus norvegicus)中克隆得到(el-Maghrabiet al,1988)。已有關(guān)于部分水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物FBP的研究報(bào)道，如凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的肝胰腺具有糖異生的能力(Rosaset al,1999)；大菱鲆(Scophthalmus maximus)在不同喂食情況下，其FBP在各個(gè)組織中的表達(dá)量不同(Nieet al,2015)；銀鯽(Carassius auratus gibelio)被證實(shí)存在肝臟型和肌肉型2種FBP同工酶(王銳等,2010)等。目前，尚未有貝類FBP的報(bào)道。關(guān)于FBP在溫度脅迫條件下的研究主要集中于植物(徐文亭等,2013; 何斌等,2015; 陳虎等,2016; 曲玲等,2015)，貝類FBP基因的相關(guān)功能有待進(jìn)一步的研究。

貝類屬于變溫動(dòng)物，溫度的變化對(duì)貝類的生命活動(dòng)有顯著的影響(Kimet al,2009; Cotteret al,2010; Ivaninaet al,2013)。馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)又稱合浦珠母貝，是中國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖的主要品種，廣泛分布于廣東、廣西和海南沿海等地，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(田榮榮等,2015)。晝夜溫差的變化、一年四季的更替及無(wú)法控制的自然災(zāi)害帶來(lái)的溫度驟變都會(huì)對(duì)馬氏珠母貝造成很大的負(fù)面影響。目前，有關(guān)馬氏珠母貝對(duì)溫度變化的響應(yīng)機(jī)制研究較少。本研究采用RACE技術(shù)獲得Pm-FBP的基因序列全長(zhǎng)，并研究了其在不同溫度下的時(shí)序表達(dá)模式，以期為深入研究馬氏珠母貝溫度脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的馬氏珠母貝采自廣東省雷州市后洪村海區(qū)，將貝體表面的附著物清理干凈后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，22℃暫養(yǎng)2 d后，選取鱗片旺盛、活力正常的馬氏珠母貝用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)貝殼長(zhǎng)為(69.23±3.80) mm。其中，隨機(jī)取6只馬氏珠母貝的全組織，包括閉殼肌、鰓、性腺、肝胰腺、足和外套膜，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱備用。

150只馬氏珠母貝隨機(jī)分為3組，分別置于3個(gè)300 L的實(shí)驗(yàn)桶中，微充氣養(yǎng)殖，水溫分別設(shè)為17℃(低溫組)、22℃(對(duì)照組)和32℃(高溫組)，養(yǎng)殖過(guò)程中每天投喂等量的單胞藻，每天換水50%。在實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖開(kāi)始后6 h、24 h、72 h和120 h，分別從每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中隨機(jī)取8個(gè)個(gè)體，剪取鰓組織，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

Trizol、SYBR Select Master Mix和GeneJET Gel Extraction購(gòu)買于Life Technologies公司；DH5α大腸桿菌(Escherichia coli)以及RACE試劑盒(Clontech)購(gòu)買于TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 Pm-FBP全長(zhǎng)克隆

1.3.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 采用Trizol法分別提取馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、性腺、肝胰腺、足和外套膜的總RNA。3′ RACE和5′ RACE模板的制備參考SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)所需引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列 Tab.1 Primer sequences

1.3.3 RACE PCR獲得Pm-FBP全長(zhǎng)序列 利用引物Pm-FBP-F/Pm-FBP-R進(jìn)行Pm-FBP中間片段的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將與目的片段長(zhǎng)度一致的PCR產(chǎn)物和載體pMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性菌送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的Pm-FBP中間片段、3′和5′序列與馬氏珠母貝基因組(Duet al,2017)中已知的部分進(jìn)行比對(duì)，利用軟件將獲得的Pm-FBP中間片段與3′和5′的序列片段進(jìn)行拼接，最終得到Pm-FBP全長(zhǎng)序列。

1.3.4 Pm-FBP的生物信息學(xué)分析 利用SMART在線分析工具確定本研究克隆所得的cDNA序列為FBP基因；利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)；ORF Finder軟件找到Pm-FBP的開(kāi)放閱讀框；ExPASy- ProtParam tool進(jìn)行氨基酸的理化性質(zhì)分析(王玉紅等,2018)；SignalP 4.1軟件進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)；TMHMM Server軟件分析氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)(王修芳等,2016)；SWISS-MODEL軟件進(jìn)行氨基酸三級(jí)結(jié)構(gòu)分析(曲玲等,2015)；通過(guò)多序列比對(duì)，將Pm-FBP與部分已知物種的FBP氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；利用Mega 6.0構(gòu)建生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(王竹青等,2018)。

1.3.5Pm-FBP在各組織以及不同溫度下鰓中的時(shí)序表達(dá)差異 本研究以β-actin為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計(jì)算Pm-FBP基因在不同組織以及實(shí)驗(yàn)溫度下各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量，分別以外套膜和22℃組為對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理以后，利用SPSS軟件以進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)、組間表達(dá)量均值比較和Duncan多重比較(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pm-FBP序列分析

本研究通過(guò)RACE技術(shù)獲得了Pm-FBP的全長(zhǎng)序列。Pm-FBP總長(zhǎng)為1381 bp，5′ UTR為54 bp，3′ UTR為62 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為1020 bp，編碼339個(gè)氨基酸(圖1)。Pm-FBP無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，具有FBP保守的FBPase結(jié)構(gòu)域，1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，6個(gè)潛在的O-連接糖基化位點(diǎn)(Ser36、Ser56、Ser57、Ser76、Ser80和Thr115)，46個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2.2 Pm-FBP質(zhì)理化性質(zhì)分析

圖1 Pm-FBP的核苷酸序列分析 Fig.1 The nucleotide sequence analysis of Pm-FBP

Pm-FBP的理論分子量為37.13 kDa，等電點(diǎn)為6.02。其中，含量較高的氨基酸有Gly(G) 8.8%，Ser(S) 8.6%，Leu(L) 8.0%；帶負(fù)電的殘基總數(shù)(Asp+Glu) 為40個(gè)，正電的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為37個(gè)；脂溶指數(shù)是86.58，平均親水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.211，為親水性蛋白(圖2)。FBP的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，α螺旋結(jié)構(gòu)占整體的30.97%，β轉(zhuǎn)角為11.50%，延伸鏈為22.71%，無(wú)規(guī)則卷曲為34.81%。

2.3 FBP多序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為確定Pm-FBP與其他物種的同源性，將Pm-FBP與長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)、蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)、文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri)和果蠅(Drosophila elegans)的FBP序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，Pm-FBP與長(zhǎng)牡蠣FBP相似度最高，為83%(圖3)。對(duì)Pm-FBP進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，與長(zhǎng)牡蠣、蝦夷扇貝FBP的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)三者的相似性極高，都以無(wú)規(guī)則卷曲為主(圖4)，說(shuō)明FBP在三維結(jié)構(gòu)上的保守性較高。

圖2 Pm-FBP的疏水性 Fig.2 The hydrophobicity of Pm-FBP

將Pm-FBP與長(zhǎng)牡蠣、蝦夷扇貝、章魚(yú)(Octopus bimaculoides)、海兔(Aplysia californica)、美洲鱟(Limulus polyphemus)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、凡納濱對(duì)蝦、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)、文昌魚(yú)、錦龜(Chrysemys picta bellii)、鰷魚(yú)(Cyprinodon variegatus)、紅樹(shù)林鳉魚(yú)(Kryptolebias marmoratus)的FBP基因序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，F(xiàn)BP先與長(zhǎng)牡蠣、蝦夷扇貝匯聚一支，再與其他軟體動(dòng)物匯聚成一支，節(jié)肢動(dòng)物和脊椎動(dòng)物分別匯聚成兩支(圖5)，這與傳統(tǒng)的分類基本一致。

2.4 Pm-FBP在馬氏珠母貝不同組織中的表達(dá)量檢測(cè)

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Pm-FBP在馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、性腺、肝胰腺、足和外套膜的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示，Pm-FBP基因在不同組織中表達(dá)量的變化從高到低依次為GO＞HE＞GI＞M＞F＞A，Pm-FBP在性腺中表達(dá)量最高(P＜0.05)，其次是肝胰腺和鰓，足和外套膜的表達(dá)量較低，閉殼肌中幾乎不表達(dá)。

2.5 不同溫度下馬氏珠母貝鰓中FBP的時(shí)序表達(dá)

實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Pm-FBP在鰓中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，Pm-FBP在高溫組和低溫組的表達(dá)量都出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)，且均在72 h時(shí)達(dá)到最大值(P＜0.05)，由此可推測(cè)，該基因與馬氏珠母貝環(huán)境溫度脅迫存在很強(qiáng)的相關(guān)性；120 h時(shí)，高溫組和低溫組Pm-FBP表達(dá)量均顯著下降(P＜0.05)，說(shuō)明Pm-FBP很可能主要在短期溫度脅迫中起重要作用(圖7)。

3 討論

本研究利用RACE技術(shù)克隆獲得Pm-FBP全長(zhǎng)序列，該基因全長(zhǎng)為1381 bp，共編碼339個(gè)氨基酸。Pm-FBP具有FBP共有的一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域Pfam FBPase(曲玲等,2015; Cota-Ruizet al,2015)，證實(shí)了本研究克隆所得到的序列為Pm-FBP。FBP是糖異生過(guò)程中的關(guān)鍵酶，受到異構(gòu)調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾和激素等機(jī)制的共同調(diào)節(jié)(王銳等,2010)。其中，共價(jià)修飾又包括蛋白的磷酸化和去磷酸化(Wanget al,2017)。Pm-FBP中存在46個(gè)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)O-連接糖基化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，也說(shuō)明FBP可能通過(guò)蛋白質(zhì)磷酸化修飾和糖基化來(lái)行使其蛋白功能(陳虎等,2016)。此外，Pm-FBP中存在1個(gè)FBPase序列基序DPLDGSS(Asp-Pro-Ile/Leu-Asp-Gly/Ser-Thr/Ser)，此基序已被證明能夠結(jié)合金屬離子參與催化(Yorket al,1995)，與FBPase需要金屬離子催化的結(jié)論相符(Serratoet al,2009; Rakuset al,2013)。序列比對(duì)結(jié)果表明，Pm-FBP與長(zhǎng)牡蠣FBP同源性最高，為83%；Pm-FBP與長(zhǎng)牡蠣、蝦夷扇貝的FBP三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似，說(shuō)明Pm-FBP在雙殼類動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Pm-FBP在肝胰腺有較高水平的表達(dá)，與大菱鲆(Nieet al,2015)、銀鯽(王銳等,2010)的研究結(jié)果一致。此外，研究表明，貝類處于繁殖期時(shí)，需要大量的能量?jī)?chǔ)備用于精卵發(fā)育。在性腺發(fā)育過(guò)程中，貝體攝食獲得的粗蛋白和粗脂肪含量隨著精卵細(xì)胞的發(fā)育成熟不斷增加，然后在休止期大量流失，糖類的含量在增殖期開(kāi)始下降，成熟期達(dá)到最低，排放期后急劇升高，貝體肥滿度及生化成分變化與繁殖周期的變化有著密切的關(guān)系(程亮等,2013; Mendoet al,2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，Pm-FBP在性腺中高表達(dá)(P＜0.05)，說(shuō)明FBP作為能量產(chǎn)生途徑的關(guān)鍵酶，可能參與了性腺發(fā)育過(guò)程中的能量提供。

溫度脅迫對(duì)貝類生理代謝具有顯著影響。研究表明，海水溫度劇烈變化時(shí)，急劇的水溫變化對(duì)蝦夷扇貝(吳彪等,2016; 高振錕等,2017)、櫛孔扇貝(Azumapecten farreri)(Jianget al,2017)和文蛤(Meretrix meretrixL)(馮建彬等,2004)等海洋貝類的攝食能力、呼吸及排泄等均有較大影響。此外，溫度能夠直接影響貝體的新陳代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響貝體的能量收支和生長(zhǎng)過(guò) 程(姜娓娓等,2017)。糖異生作用是在機(jī)體處于饑餓狀態(tài)下，各種非糖苷底物經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成內(nèi)源性葡萄糖的過(guò)程，以保證機(jī)體的血糖處于正常水平(宮官等,2013)。FBP作為催化糖異生過(guò)程中的限速酶，關(guān)于FBP應(yīng)對(duì)溫度脅迫的研究主要集中在植物(徐文亭等,2013; 何斌等,2015)，貝類中關(guān)于溫度脅迫與FBP的關(guān)系尚未明確。鰓是貝類的重要的代謝器官，具有呼吸和濾食等多種功能。作為與外界接觸的器官，水溫的變化能夠直接影響鰓的功能以及作用。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Pm-FBP在低溫組、對(duì)照組和高溫組馬氏珠母貝鰓的時(shí)序表達(dá)模式。結(jié)果表明，Pm-FBP表達(dá)量在高溫組和低溫組都出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)，且均在72 h時(shí)達(dá)到最大值(P＜0.05)，由此可推測(cè)，該基因與馬氏珠母貝生存環(huán)境溫度和脅迫存在很強(qiáng)相關(guān)性；120 h時(shí)高溫組和低溫組Pm-FBP表達(dá)量均顯著下降(P＜0.05)，這說(shuō)明Pm-FBP很可能主要在短期溫度脅迫中起重要作用。在植物體處于高溫情況下，F(xiàn)BP基因在短期會(huì)有一個(gè)應(yīng)激上調(diào)的過(guò)程，但在長(zhǎng)期高溫情況下，F(xiàn)BP表達(dá)會(huì)趨于穩(wěn)定(陳虎等,2016; 曲玲等,2015)，與本研究的高溫組結(jié)果一致。推測(cè)貝體處于溫度脅迫條件下，機(jī)體代謝水平下降，總糖含量處于較低水平，F(xiàn)BP通過(guò)參與糖異生過(guò)程使馬氏珠母貝機(jī)體的糖含量處于正常水平。本研究結(jié)果證明了Pm-FBP基因可能是馬氏珠母貝在適應(yīng)溫度驟變環(huán)境過(guò)程中的重要基因，為馬氏珠母貝抗逆基因篩選以及溫度脅迫響應(yīng)機(jī)制的深入研究提供參考資料。

圖3 Pm-FBP的多序列比對(duì) Fig.3 Multisequence alignment of Pm-FBP

圖4 馬氏珠母貝(A)、長(zhǎng)牡蠣(B)和蝦夷扇貝(C) FBP蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu) Fig.4 The spatial structure of FBP Protein molecules in P.fucata martensii (A) ,C.gigas(B) and M.yessoensis(C)

圖5 Pm-FBP的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) Fig.5 The phylogenetic tree of Pm-FBP

圖6 Pm-FBP在馬氏珠母貝不同組織中的表達(dá)分布 Fig.6 Pm-FBP gene expression profiles in different tissues of P.fucata martensii

圖7 不同溫度下馬氏珠母貝鰓中Pm-FBP基因的時(shí)序表達(dá) Fig.7 Temporal expression of the Pm-FBP gene in the gills of P.fucata martensii at 17℃,22℃,and 32℃