黃夢詩 楊倩倩 張 艷 姜曉瑜 趙 俊 張旭志,3 丁東生 曲克明,3①

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院 上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)嗜鹽畏酸，廣泛存在于海洋環(huán)境及海產(chǎn)品中，可以感染多種動物，甚至危害人類健康(如食用受其污染的海產(chǎn)品可能會導(dǎo)致急性腸胃炎)(Bakeraustinet al,2010; Bonninjusserandet al,2017; Hamet al,2012; Liuet al,2017; 黃夢詩等,2017)。無論是從科學(xué)研究角度還是從保障食品安全等生產(chǎn)與生活需求方面來講，對 影響該病原菌生長的環(huán)境因子作用機理進行研究都具有重要現(xiàn)實意義(Younget al,2015)。截至目前，相關(guān)研究已經(jīng)獲得了初步的成果，如Johnson等(2010、2012)從生態(tài)學(xué)角度研究了美國近岸海域中VP與環(huán)境溫度和鹽度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)無論是水體、生物體還是沉積物中，其總量與這2個參數(shù)都呈正相關(guān)；Young等(2015)研究了海產(chǎn)品和漁業(yè)水域中VP受溫度和鹽度的影響，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)溫度的升高利于該病原菌的生長，而鹽度的影響則不明確；然而，Johnson等(2010)的研究表明，水體中鹽度和VP總量呈負相關(guān)；孫博懌等(2015)發(fā)現(xiàn)，pH、電導(dǎo)率、鹽度較其他海域偏低的長江入?？谒畼又蠽P總量較多，但多元線性回歸方程分析卻表明鹽度和溫度與該菌含量呈正相關(guān)；Kaper等(1979)和Rehnstam-Holm等(2014)的研究皆表明，水體中VP總量與pH呈負相關(guān)。此外，由于海水中營養(yǎng)鹽等其他理化因子也對該菌的生長、分布具有重要的影響，諸如氨氮(Blackwellet al,2008)、濁度(Johnsonet al,2012)、生物需氧量(Johnsonet al,2010)等也得到了較多的研究(Johnson,2015)。上述研究多基于單因子效應(yīng)分析，數(shù)據(jù)間關(guān)聯(lián)性較差，不能充分反映交互作用，很可能是結(jié)論不能統(tǒng)一的主要原因。因此，具有較高契合度的綜合性分析預(yù)評估方法有待建立。

響應(yīng)面方法(Response surface methodology,RSM)是數(shù)學(xué)和統(tǒng)計方法結(jié)合的產(chǎn)物，常被應(yīng)用于尋找多參數(shù)系統(tǒng)中的最佳條件(Karamiet al,2016; Kumaret al,2012; 韓建榮等,2017; 蔣彪等,2017; 陳曉彤等,2017)，該方法不僅可以同時對影響生物量的各因素和各因素的相互作用進行比較和優(yōu)化，還可以快速確定出各因素的最優(yōu)水平，減少實驗次數(shù)，節(jié)約時間，目前已被廣泛應(yīng)用于微生物培養(yǎng)基優(yōu)化中(韓建榮等,2017; 蔣彪等,2017)。本研究采用RSM研究溫度、鹽度、pH、磷酸鹽、硝氮和氨氮對VP的生長影響，獲得具有較好準確性的響應(yīng)模型，并探討、評估了這6種理化因子的綜合作用結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 生物、化學(xué)材料與主要設(shè)備

實驗所用副溶血弧菌(ACTT17802)為本實驗室保存。胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)為青島高科海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。NaNO3、NH4Cl、Na3PO4、NaCl和其他化學(xué)試劑皆為分析純，其中，NaNO3和NH4Cl為上海強順化工有限公司產(chǎn)品，余者皆購自于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。細菌培養(yǎng)采用上海知楚儀器公司生產(chǎn)的ZQZY-BG型振蕩培養(yǎng)箱。細菌培養(yǎng)液光密度(OD600 nm)值采用TU-1901/TU-1901型紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)測定。溶液酸堿度采用上海精科儀器有限公司生產(chǎn)的PHS-3C型pH計完成。接種實驗在10000級潔凈無菌室內(nèi)完成。

1.2 實驗方法

所有培養(yǎng)基都選用TSB。將本實驗室于-80℃冰箱中保藏的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h以活化菌種。將活化好的菌種接種到TSB液體培養(yǎng)基中，同時做3組平行，置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)12 h，每隔1 h取樣1次,600 nm下測定培養(yǎng)液吸光度(OD600 nm值)。

溫度、鹽度和pH對VP生長的影響實驗參照劉代新等(2008)，簡言之：以向TSB培養(yǎng)液中添加NaCl的百分含量作為鹽度，配制1%～10%共10個梯度；溫度實驗為10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、43℃共7個梯度；采用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)液酸堿度，配制pH 5.00、6.00、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00和10.00共8個梯度。向上述各液體培養(yǎng)基中各接菌1環(huán)，分別培養(yǎng)并測定OD值。分析結(jié)果，確定適合 VP生長的最佳單因素條件范圍，并依據(jù)RSM中的Box Behnken 中心組合原則，采用Design-Expert 軟件進行分析。然后選用分析所得的最佳生長復(fù)合參數(shù)培養(yǎng)VP,并測定培養(yǎng)18 h后培養(yǎng)液的 OD600 nm值(n=3)以證實該方法的可靠性。

磷酸鹽、硝酸鹽和氨鹽對VP的生長影響實驗如下：在上述優(yōu)化參數(shù)基礎(chǔ)上，分別以Na3PO4、NaNO3和NH4Cl作為磷酸鹽、硝氮和氨氮的代表種類，分別配制含有0.2%～1%共9個梯度的TSB培養(yǎng)液。然后按照上述方法培養(yǎng)8 h后測定VP的生長情況。為了保證合適的鹽度，如非特殊說明，實驗所用的培養(yǎng)液含3% NaCl。

1.3 數(shù)據(jù)處理

RSM是通過一系列確定性實驗，用多項式函數(shù)來近似隱式極限狀態(tài)函數(shù)。通過合理地選取試驗點和迭代策略，來保證多項式函數(shù)能夠在失效概率上收斂于真實的隱式極限狀態(tài)函數(shù)的失效概率。實驗采用 Design expert 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，對溫度、鹽度等環(huán)境理化因子與VP生長響應(yīng)值進行二次方程回歸擬合，建立數(shù)學(xué)模型，用決定系數(shù)和回歸方程的校正系數(shù)來判斷數(shù)學(xué)模型的擬合程度，多變量方差分析決定方程的意義(Karamiet al,2016)。優(yōu)化得到的實驗條件重復(fù)3次，以驗證模型的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度、鹽度和pH對VP生長的單因子影響

如圖1A所示，環(huán)境溫度為10℃時，VP基本上沒有增殖；在20℃～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，8 h后VP培養(yǎng)液的OD值持續(xù)增加，最高值可達約1.5；而超過35℃時，OD值則明顯下降，說明35℃左右的環(huán)境溫度最有利于VP的生長。由圖1B可見， 在1%～3%范圍內(nèi)，隨著鹽度的增加，8 h后VP培養(yǎng)液的OD值持續(xù)增加，最高值可達1.8；鹽度高于3%情況下，8 h后VP培養(yǎng)液的OD值隨之增加而降低；鹽度為10%時，VP則幾乎不能生長。同樣，由圖1C可知，在pH5.0～8.0范圍內(nèi)，其值的增加有利于VP的生長，而超過pH8.0后，酸堿度值與OD值呈負相關(guān)。這些結(jié)果和前人的報道(Beuchatet al,1973; 劉代新等,2008)吻合良好。

圖1 溫度(A)、鹽度(B)和pH(C)對VP生長的影響 Fig.1 Effects of the temperature(A),salinity(B) and pH(C) on the growth of VP

2.2 溫度、鹽度和pH對VP生長交互作用的RSM分析方案與結(jié)果

根據(jù)單因子影響結(jié)果，我們選擇合適的參數(shù)范圍進行三因素三水平RSM設(shè)計與實驗，其方案與結(jié)果見表1。利用Design expert 8.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到VP培養(yǎng)8 h后的OD600 nm值與x(溫度)、x1(鹽度)、x2(pH)之間的二元多項回歸方程為：

對該模型進行方差分析見表2。表2結(jié)果顯示出，基于OD值所建立的回歸模型是顯著的(P＜0.01)，但是失擬檢測結(jié)果也十分顯著(P=0.0014＜0.01)，所以這個方程由于失擬檢測很小，表明擬合方程可能會無效。但是實驗中的純誤差均方較小(MS=0.005)，決定系數(shù)R2=0.9649，校正系數(shù)R=0.9198，所以綜合考慮所有因素在內(nèi)，擬合方程滿足有效要求。

表3為回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果。由表3可以看出，pH的一次效應(yīng)對VP的生長影響達到顯著水平(P＜0.05)，但溫度和鹽度的一次效應(yīng)對其生長影響不顯著(P＞0.05)；溫度和鹽度的二次效應(yīng)對VP的生長影響達到顯著水平(P＜0.01)；但溫度、鹽度和pH三者之間的交互作用對特定生長率的影響都不顯著(P＞0.05)。

利用Design-Expert 軟件對表1的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖2。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強弱大小,圓形表示2個因素交互作用不顯著,橢圓形表示2個因素交互作用顯著(Karamiet al,2016; 劉代新等,2008)。由圖2可見，溫度和鹽度對OD值的影響都是隨著數(shù)值的增大先升高后降低，所以可以找到一個極值點；等高線圖接近橢圓形，表明溫度、鹽度交互作用對VP的生長影響顯著。利用Design-Expert軟件對代表培養(yǎng)液中菌體濃度的OD值的二次多項式數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得知pH為8.00時，溫度和鹽度的最優(yōu)實驗條件分別為：34.5℃和3%。

表1 溫度、鹽度、pH響應(yīng)面分析方案與實驗結(jié)果 Tab.1 Experimental results and RSM scheme of temperature,salinity and pH

表2 溫度、鹽度和pH對VP生長情況的回歸模型方差分析 Tab.2 Analysis of variance for effects of temperature,salinity and pH on the growth of VP

2.3 磷酸鹽、硝氮和氨氮對VP生長的單因子影響

選用最優(yōu)的溫度、鹽度和pH參數(shù)，實驗繼續(xù)探討了磷酸鹽、硝酸鹽和氨鹽對VP生長的單因子影響。如圖3A所示，當濃度超過0.2%后，培養(yǎng)液中Na3PO4與OD值呈明顯的負相關(guān)，當其值≥0.6%時幾乎徹底抑制了VP的生長。圖3B顯示在加入0.2%～0.4% NaNO3時，OD值隨培養(yǎng)時間的增加快速增大(12 h范圍內(nèi))，但是加入濃度在0.6%～1%范圍內(nèi)時，OD值增長則明顯減慢，因而呈明顯的負相關(guān)。由圖3C可知，類似于NaNO3對VP生長的影響，在0.2%～1%范圍內(nèi)，培養(yǎng)液中NH4Cl濃度的增加與OD值增速也呈明顯的負相關(guān)，雖然其值為1%時還不至于徹底抑制VP的生長。比較而言，同濃度的Na3PO4抑制作用明顯強于硝酸鹽和氨鹽；NaNO3和NH4Cl的抑制作用則沒有明顯差別。

表3 溫度、鹽度和pH回歸方程系數(shù)顯著性檢測 Tab.3 The significance test for coefficients of established regression equation for temperature,salinity and pH

2.4 磷酸鹽、硝氮和氨氮對VP生長交互作用的RSM分析方案與結(jié)果

根據(jù)單因子影響結(jié)果，我們選擇合適的參數(shù)范圍進行三因素三水平RSM設(shè)計與實驗，其方案與結(jié)果見表4。利用Design expert 8.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到以x3(Na3PO4)、x4(NaNO3)、x5(NH4Cl)為自變量，以VP培養(yǎng)8 h后的OD600 nm值為因變量的二元多項回歸方程為：

對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，表5為Na3PO4、NaNO3和NH4Cl對VP生長影響的回歸模擬分析表。從表5可知，模型非常顯著(P＜0.01)。失擬誤差不顯著(P＞0.01)，并且回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9217，校正系數(shù)R2=0.8211，這些結(jié)果說明回歸模型能解釋92.17% OD600 nm響應(yīng)值的變化?；貧w模型F=9.16，P=0.004＜0.01，說明Na3PO4、NaNO3和NH4Cl對VP生長的影響的模型是有效的。因此可以用上訴的回歸模型來分析和預(yù)測磷酸鹽、硝氮和氨氮對該菌生長的影響。

圖2 溫度和鹽度(A)、pH和鹽度(B)、pH和溫度(C)交互作用對VP生長影響的響應(yīng)曲面和等高線 Fig.2 Response surface plots and contour plots of the temperature & salinity(A),pH & salinity(B) and pH & temperature(C) and their mutual interactions on the growth of VP

對其回歸模型方差分析進行顯著性檢驗(表6)，一次方程中Na3PO4、NaNO3和NH4Cl對VP生長的影響具有良好的線性(P＜0.01)，三者之間進行正交的相互效應(yīng)結(jié)果對該菌生長的影響不顯著(P＞0.05)，只有Na3PO4的二次方程顯著(P＜0.05)。

利用Design-Expert 軟件對表4的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖4。由圖4可知，代表VP數(shù)量的OD600 nm值隨著Na3PO4、NaNO3和NH4Cl中任意一種物質(zhì)濃度的增加而明顯降低，意味著磷酸鹽、硝氮和氨氮對該菌生長都具有顯著影響；等高線近似橢圓形說明磷酸鹽、硝氮和氨氮對VP的生長影響都無明顯的交作效應(yīng)(P＞0.05)。

3 討論

溫度、鹽度、pH及營養(yǎng)鹽等多種理化因子對VP的生長都具有不同程度的影響，對其進行系統(tǒng)探討有助于人們深入了解生態(tài)系統(tǒng)發(fā)展與演變規(guī)律。其中，溫度、鹽度和pH三種因子的作用自20世紀70年代就得到了科學(xué)界的重視(Beuchatet al,1973; Younget al,2015)。采用單因子分析，Beuchat等(1973)研 究了溫度、鹽度和pH對VP生存與存活規(guī)律 的影響；Randa等(2004)研究了溫度和鹽度對弧菌種群動力學(xué)的影響。而本實驗不但分析了這3種因子的單因素作用效果，還采用RSM建立了多因素復(fù)合 作用下VP的生長模型，獲得了該菌的最佳培養(yǎng)參數(shù)，其值與前人報道吻合良好。此外，二次回歸模型決定系數(shù)R2=0.9649，校正系數(shù)R2=0.9198，再次說明本實驗所建RSM分析的可靠性。較之于歷史上的其他研究方法，RSM最大的優(yōu)點是實驗次數(shù)少、靈活、方便，可以全面考慮各因素間的交互作用，并把待分析因子的實驗結(jié)果函數(shù)化，從而快速得到研究對象(們)與響應(yīng)值之間的關(guān)系(韓建榮等,2017)。因此，新方法有助于人們更便捷地理解和預(yù)測環(huán)境因子變化對VP生態(tài)動力學(xué)帶來的影響。

圖3 Na3PO4(A)、NaNO3(B)和NH4Cl(C)對VP生長的影響 Fig.3 Effects of the Na3PO4 (A),NaNO3 (B) and NH4Cl(C) on the growth of VP

表4 Na3PO4、NaNO3和NH4Cl響應(yīng)面分析方案與實驗結(jié)果 Tab.4 Experimental results and RSM scheme of Na3PO4,NaNO3 and NH4Cl

表5 Na3PO4、NaNO3和NH4Cl對副溶血弧 菌生長情況的回歸模型方差分析 Tab.5 Analysis of variance for effects of Na3PO4,NaNO3 and NH4Cl on the growth of VP

表6 Na3PO4、NaNO3和NH4Cl回歸方程系數(shù)顯著性檢測 Tab.6 The significance test for coefficients of established regression equation for Na3PO4,NaNO3 and NH4Cl

圖4 Na3PO4和NH4Cl(A)、Na3PO4和NaNO3(B)、NaNO3和NH4Cl(C)交互作用對VP生長影響的響應(yīng)曲面和等高線 Fig.4 Response surface plots and contour plots of Na3PO4&NH4Cl(A),Na3PO4&NaNO3(B) and NaNO3&NH4Cl(C) and their mutual interactions on the growth of VP

營養(yǎng)鹽，如磷酸鹽、硝氮和氨氮對VP的生長代謝也具有顯著的影響(Bjket al,2017; Crimingeret al,2007; Oliveret al,1983)。由于PO43+能螯合二價金屬陽離子，且降低細胞壁的穩(wěn)定性以及許多細胞的熱穩(wěn)定性，因而抑制細菌的生長(Mccarteret al,1987; 尹守亮等,2015)。氨氮參與生物體內(nèi)氧化還原循環(huán)，影響細胞壁上蛋白的運轉(zhuǎn)(梁艷等,2011)。目前對其毒性的研究主要集中在魚蝦類神經(jīng)元去極化(Hermenegildoet al,2000)及導(dǎo)致機體酶失活(Chinget al,2009; 尹守亮等,2015)等方面。雖然高氨氮水域中細菌的種群較少(Zhanget al,2014)，但其對細菌的具體毒理作用目前鮮有報道。目前硝氮對VP的生長也尚末得到詳細的研究。本實驗中，在單因素實驗基礎(chǔ)上利用RSM針對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽-VP生長進行分析，建立了Na3PO4、NaNO3和NH4Cl含量變化對OD600 nm值的二次回歸方程模型。通過回歸模型方差分析得知，磷酸鹽、硝氮和氨氮對VP生長影響都很顯著(負相關(guān))。這個結(jié)論很好地從側(cè)面印證了前人的報道(Bjket al,2017; Mccarteret al,1987)。通過響應(yīng)曲面和等高線圖的直觀分析可知，磷酸鹽、硝氮和氨氮之間的交互作用影響不明顯。