范耘碩 邵 蓬 賈旭穎 高金偉 竇 勇 史謝堯 周文禮

(天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 天津 300384)

水產(chǎn)動(dòng)物在養(yǎng)殖與運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)受到多種脅迫因子的影響。機(jī)體在脅迫作用下的應(yīng)激反應(yīng)分為三級(jí)(Wendelaar Bonga,1997)，其中，主要應(yīng)激反應(yīng)包括兒茶酚胺和皮質(zhì)醇循環(huán)水平的增加；繼發(fā)性應(yīng)激反應(yīng)由主要反應(yīng)引起，包括能量調(diào)動(dòng)的增加，主要表現(xiàn)為高血糖和脂質(zhì)代謝量的上升，為應(yīng)對(duì)脅迫提供了必要的能量。其他繼發(fā)性應(yīng)激反應(yīng)與體內(nèi)滲透壓及心血管、呼吸和免疫功能有關(guān)(Barton,2002)。而主要應(yīng)激反應(yīng)與繼發(fā)性應(yīng)激反應(yīng)可能會(huì)引起影響魚(yú)體機(jī)能的三級(jí)應(yīng)激反應(yīng)，如生長(zhǎng)性能、繁殖能力和存活率等(Schreck,2010)。溫度脅迫是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中重要的脅迫因子之一，魚(yú)類(lèi)對(duì)水溫變化的響應(yīng)主要表現(xiàn)為攝 食量、生長(zhǎng)周期、繁殖率和存活率等生理生化指標(biāo)的變化(李勇等,2011)?？寡趸竿ǔ４嬖谟诤醚跎锏母鞣N組織中，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)是水生動(dòng)物重要的抗氧化因子，可以除去體內(nèi)過(guò)量的活性氧自由基(成艷波等,2017)?？寡趸富盍χ苯邮軠囟日{(diào)控，環(huán)境溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)導(dǎo)致抗氧化酶活力下降(劉峰等,2016; 羅偉等,2017)。非特異性免疫是魚(yú)類(lèi)免疫反應(yīng)的主要機(jī)制，溶菌酶(Lysozyme,LZM)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)是這一過(guò)程中的2個(gè)關(guān)鍵酶(薛寶貴等,2013)。溫度也是刺激魚(yú)類(lèi)非特異性免疫機(jī)能變化的主要環(huán)境因素之一，當(dāng)環(huán)境溫度低于魚(yú)類(lèi)最適水溫時(shí)，魚(yú)體的免疫反應(yīng)通常會(huì)降低或延遲，而過(guò)高的水溫會(huì)則造成與免疫相關(guān)酶活力的喪失，影響魚(yú)類(lèi)正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)(Raidaet al,2007; Bowden,2008)。

大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)為鯉形 目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、副泥鰍屬(Paramisgurnus)，屬溫水性魚(yú)類(lèi)，具有口感風(fēng)味佳，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，生長(zhǎng)速度快，環(huán)境耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為東亞地區(qū)，特別是中國(guó)和韓國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一(Youet al,2011; Xiaet al,2011; Zhanget al,2015)。目前，關(guān)于溫度脅迫對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物影響的研究多見(jiàn)于常見(jiàn)或名貴水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，而關(guān)于溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍的研究較少。本研究以大鱗副泥鰍為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行4種溫度下12 h的脅迫實(shí)驗(yàn)及24 h的恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定肝臟和血清中部分抗氧化與非特異性免疫指標(biāo)的變化，以期為評(píng)價(jià)大鱗副泥鰍對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)與飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)由天津鴻騰水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司提供，體重為(38.20±3.70) g，體長(zhǎng)為(19.3±2.8) cm。實(shí)驗(yàn)用魚(yú)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)水溫為22℃。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，選取大小均勻、體格健壯、活力較強(qiáng)的個(gè)體，禁食24 h后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為脅迫期與恢復(fù)期，實(shí)驗(yàn)共36 h，其中，脅迫期為12 h，分為4個(gè)處理，分別標(biāo)記為對(duì)照組、高溫組、降溫組和低溫組，對(duì)應(yīng)水溫分別為22℃、29℃、15℃和8℃，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行使用60 L玻璃水槽養(yǎng)殖容器，每個(gè)水槽中隨機(jī)放60尾魚(yú)。使用加熱棒和制冷循環(huán)水機(jī)控制溫度，各水槽溫度誤差為±0.5℃，每20 min檢測(cè)1次水溫；恢復(fù)期為24 h，各處理水溫快速調(diào)整至(22±0.5)℃。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣48 h的自來(lái)水，實(shí)驗(yàn)期間使用氣泵充氣，水體pH為8.5～8.0，溶解氧為6.1～ 7.3 mg/L，總N濃度為0.2～0.3 mg/L。

1.2 樣品采集

在脅迫期的第1、2、4、8、12 h及恢復(fù)期的第4、8、12、24 h(以r-4、r-8、r-12和r-24 h表示)分別取血清和肝臟樣品，每次隨機(jī)從各槽中取出5尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)，使用MS-222(0.5 mg/L)麻醉后，進(jìn)行尾靜脈取血，將取出的血液轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管后，4℃靜置2 h，4℃條件下，3000 r/min離心10 min，取上清液，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存；取血后，在冰盤(pán)上解剖實(shí)驗(yàn)魚(yú)，取肝臟，用4℃去離子水沖洗，并按1∶9(W/V)加入預(yù)冷生理鹽水(4℃，0.86%)，使用玻璃勻漿器在冰水浴中勻漿，制成10%組織勻漿液，4℃條件下3500 r/min離心10 min，取上清液，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟樣品中的CAT、SOD、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、LZM及AKP分別采用南京建成生物工程研究所提供的A007-2過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(可見(jiàn)光法)、A001-1總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒(羥胺法)、A003-1丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)、A050-1溶菌酶(LZM)檢測(cè)試劑盒(比濁法)以及A059-1堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒(可見(jiàn)光比色法)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定儀器為SHIMADZU紫外UVmini-1240可見(jiàn)分光光度計(jì)，Thermo Scientific Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(多功能酶標(biāo)儀)；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase,AST)含量使用東芝TBA-120FR全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定；使用考馬斯亮藍(lán)G250染料結(jié)合法測(cè)定總蛋白質(zhì)含量(Bradford,1976)。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。使用IBM SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較，設(shè)定P值為0.05，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組SOD活力基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟SOD活力(P＜0.05)，至脅迫期結(jié)束 (12 h)，各實(shí)驗(yàn)組SOD活力均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其中，高溫組SOD活力最低，顯著低于其他處理組(P＜0.05)。恢復(fù)期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組SOD活力均逐漸升高，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(r-24 h)，各實(shí)驗(yàn)組SOD活力基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)(圖1)。對(duì)照組CAT活力在實(shí)驗(yàn)期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟CAT活力(P＜0.05)，至脅迫期結(jié)束(12 h)，各實(shí)驗(yàn)組CAT活力均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其中，高溫組顯著高于降溫組與低溫組(P＜0.05)?；謴?fù)期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組CAT活力均逐漸升高，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(r- 24 h)，各實(shí)驗(yàn)組CAT活力基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞ 0.05)(圖2)。對(duì)照組MDA含量在實(shí)驗(yàn)期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著升高肝臟MDA含量(P＜0.05)，至脅迫期結(jié)束(12 h)，各實(shí)驗(yàn)組MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其中，低溫組顯著高于高溫組(P＜0.05)?；謴?fù)期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組MDA均逐漸下降，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(r-24 h)，各實(shí)驗(yàn)組MDA含量基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)(圖3)。

2.2 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟LZM與AKP活力的影響

圖1 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟SOD活力的影響 Fig.1 Effects of temperature stress on SOD activity of P.dabryanus

實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組LZM活力基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟LZM活力(P＜0.05)，至脅迫期結(jié)束(12 h)，各實(shí)驗(yàn)組LZM活力均顯著低于對(duì)照組(P＜ 0.05)?；謴?fù)期內(nèi)，高溫組LZM活力基本穩(wěn)定，降溫組與低溫組逐漸升高，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(r-24 h)，高溫組LZM活力顯著低于其他各組(P＜0.05)，降溫組與 低溫組基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)(圖4)。對(duì)照組AKP活力在實(shí)驗(yàn)期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著降低肝臟AKP活力(P＜0.05)，至脅迫期結(jié)束(12 h)，各實(shí)驗(yàn)組AKP活力均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)?；謴?fù)期內(nèi)，高溫組AKP活力基本穩(wěn)定，降溫組與低溫組逐漸升高，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(r-24 h)，高溫組AKP活力顯著低于其他各組(P＜0.05)，降溫組與低溫組基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)(圖5)。

2.3 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍血清轉(zhuǎn)氨酶含量的影響

實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組AST含量基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著升高肝臟AST含量(P＜0.05)，至脅迫期結(jié)束(12 h)，各實(shí)驗(yàn)組AST含量均顯著高于對(duì)照組(P＜ 0.05)?；謴?fù)期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組AST含量均呈先升高后下降的趨勢(shì)，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(r-24 h)，各實(shí)驗(yàn)組AST 含量基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)(圖6)。對(duì)照組ALT含量在實(shí)驗(yàn)期間基本穩(wěn)定。溫度脅迫顯著升高血清ALT含量(P＜0.05)，至脅迫期結(jié)束(12 h)，各實(shí)驗(yàn)組ALT含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其中高溫組顯著高于降溫組?；謴?fù)期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組ALT含量均呈先升高后下降的趨勢(shì)，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)(r-24 h)，高溫組ALT活力顯著高于其他各組(P＜0.05)，降溫組與低溫組基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)(圖7)。

圖4 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟LZM活力的影響 Fig.4 Effects of temperature stress on LZM activity of P.dabryanus

圖5 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟AKP活力的影響 Fig.5 Effects of temperature stress on AKP activity of P.dabryanus

3 討論

3.1 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟抗氧化指標(biāo)相關(guān)酶活力的影響

圖6 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍血清AST含量的影響 Fig.6 Effects of temperature stress on AST content of P.dabryanus

圖7 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟ALT含量的影響 Fig.7 Effects of temperature stress on ALT content of P.dabryanus

應(yīng)激可以通過(guò)細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合物功能增加肝細(xì)胞色素P450產(chǎn)生活性氧自由基的能力(Kato,1977)，而過(guò)量的自由基會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷。SOD通過(guò) 去除自由基來(lái)平衡氧化和抗氧化過(guò)程，從而防止細(xì)胞損傷；CAT催化H2O2分解為氧和水，阻斷高活力羥基自由基反應(yīng)，并阻止H2O2的毒性細(xì)胞效應(yīng)(van der Oostet al,2003; Gület al,2004)。而作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，MDA濃度是反映體內(nèi)氧自由基數(shù)量的重要指標(biāo)(Mourenteet al,1999)。研究表明，溫度脅迫會(huì)對(duì)影響魚(yú)類(lèi)抗氧化系統(tǒng)造成影響。對(duì)石斑魚(yú)雜交后代(Epinephelus moara♀ ×Epinephelus lanceolatus♂)的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會(huì)使實(shí)驗(yàn)魚(yú)CAT活力呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，導(dǎo)致幼魚(yú)免疫力和抗氧化能力下降(邵彥翔等,2017)。謝明媚等(2015)在銀鯧(Pampus argenteus)幼魚(yú)的急性溫度脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，急性溫度脅迫會(huì)在一定程度上引起實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟的損傷，并對(duì)其抗氧化能力和免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生影響。彭婷等(2012)對(duì)羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)的低溫脅迫研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫 度降低，羅非魚(yú)的生化、免疫及抗氧化指標(biāo)均發(fā)生顯著變化，由此可能導(dǎo)致羅非魚(yú)在低溫脅迫后出現(xiàn)昏迷及死亡等異常狀況。潘桂平等(2016)對(duì)云紋石斑魚(yú)(Epinephelus moara)幼魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對(duì)云紋石斑魚(yú)幼魚(yú)抗氧化和免疫性能影響顯著，低溫脅迫導(dǎo)致該魚(yú)體內(nèi)的MDA含量升高，因而肝臟合成更多 的抗氧化物質(zhì)來(lái)進(jìn)行抗氧化防御。本研究中，實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟CAT與SOD活力隨著溫度脅迫的進(jìn)行與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，至脅迫期結(jié)束，各實(shí)驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組，MDA含量在溫度脅迫過(guò)程中持續(xù)升高，至脅迫期結(jié)束各實(shí)驗(yàn)組均與對(duì)照組差異顯著，表明在溫度驟變的條件下，實(shí)驗(yàn)魚(yú)抗氧化酶活力會(huì)受到顯著抑制，抗氧化能力減弱。而進(jìn)入恢復(fù)期，各實(shí)驗(yàn)組CAT與SOD活力均逐漸提高，MDA含量逐漸降低，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)與對(duì)照組不存在顯著差異，則表明當(dāng)溫度恢復(fù)后，本實(shí)驗(yàn)溫度驟變范圍對(duì)大鱗副泥鰍肝臟抗氧化酶活力的抑制是可恢復(fù)的，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)條件下的溫度驟變不會(huì)造成大鱗副泥鰍永久性肝損傷。

3.2 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍肝臟LZM與AKP活力的影響

LZM在魚(yú)類(lèi)的體液、血清和巨噬細(xì)胞中普遍存在，是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有溶解細(xì)菌作用(殷海成等,2014)。LZM主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，但也影響一些革蘭氏陰性菌，如腸道沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，其具有抗感染、抗腫瘤、抗病毒以及增強(qiáng)抗生素的功能，起到防御病原體的重要作用(Saurabhet al,2008; Junget al,2012)。AKP是一種磷酸單酯水解酶，特異性低，起到解毒劑的作用，它在水中溶解生成乙醇和磷酸，因此，是魚(yú)類(lèi)生物健康的重要標(biāo)志(Hoseinifaret al,2015)。研究認(rèn)為，溫度脅迫會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)非特異性免疫機(jī)能產(chǎn)生影響。低溫脅迫下，河豚(Takifugu obscurus)血漿蛋白和AKP等生化指標(biāo)顯著下降，誘導(dǎo)抗氧化酶、HSP90和C3的基因表達(dá)，表明其免疫系統(tǒng)會(huì)受到低溫脅迫的影響(Chenget al,2017)。對(duì)吉富品系尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)幼魚(yú)的研究表明，溫度脅迫下實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清LZM與AKP活力在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，基本呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，認(rèn)為溫度脅迫顯著改變羅非魚(yú)幼魚(yú)的非特異性免疫能力(強(qiáng)俊等,2012)。低溫脅迫下，虹鱒(Oncorhynchus mykiss)血清的AKP活力顯著降低，并在48 h的恢復(fù)期內(nèi)維持在較低水平，而高溫脅迫下，AKP活力相比對(duì)照組略有降低(管標(biāo)等,2014)。本研究中，實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟LZM與AKP活力在脅迫期均受到溫度驟變的影響，至脅迫期結(jié)束時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組，表明溫度驟變顯著降低肝臟LZM與AKP活力，減弱機(jī)體非特異性免疫功能；進(jìn)入恢復(fù)期，高溫組LZM與AKP活力基本停留在脅迫結(jié)束時(shí)的水平，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)仍顯著低于對(duì)照組，而降溫組與低溫組LZM與AKP活力則持續(xù)升高，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，基本恢復(fù)至對(duì)照組水平，表明高溫脅迫會(huì)對(duì)大鱗副泥鰍非特異性免疫機(jī)能造成不可逆的破壞，而低溫脅迫對(duì)大鱗副泥鰍非特異性免疫機(jī)能的抑制是可恢復(fù)的，實(shí)驗(yàn)條件下不會(huì)造成永久性破壞。

3.3 溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

正常情況下，AST和ALT在包括肝臟在內(nèi)的許多器官中普遍存在，當(dāng)機(jī)體由于應(yīng)激反應(yīng)或發(fā)生病變時(shí)，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，在濃度差作用下導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的AST和ALT釋放到血液中，引起血清中的ALT和AST含量升高(孫學(xué)亮等,2010)。因此，檢測(cè)血清中AST和ALT水平的變化，可以反映細(xì)胞膜通透性的變化，并判斷肝臟等組織是否發(fā)生病變(Lemaireet al,1991; Lee,2001)。本研究中，溫度脅迫顯著升高實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清的AST與ATL含量表明溫度驟變會(huì)引起實(shí)驗(yàn)魚(yú)細(xì)胞膜通透性的變化，肝臟細(xì)胞的凋亡速度或數(shù)量增加使轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液；進(jìn)入恢復(fù)期，各實(shí)驗(yàn)組AST與ALT含量均呈下降趨勢(shì)，至恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組AST含量基本恢復(fù)到對(duì)照組水平，而ALT含量上則在降溫組與低溫組基本恢復(fù)至對(duì)照組水平，高溫組則仍顯著高于對(duì)照組。高溫條件會(huì)引起大鱗副泥鰍血液ALT含量升高，造成不可逆的破壞，而低溫條件對(duì)大鱗副泥鰍血液轉(zhuǎn)氨酶含量的影響是可恢復(fù)的，實(shí)驗(yàn)條件下不會(huì)對(duì)機(jī)體肝細(xì)胞機(jī)能造成永久性破壞。

4 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)12 h的溫度脅迫會(huì)顯著抑制大鱗副泥鰍抗氧化能力與非特異性免疫能力，且在高溫條件下對(duì)其非特異性免疫相關(guān)酶活力造成持續(xù)抑制，大鱗副泥鰍對(duì)低溫條件的耐受能力較強(qiáng)，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)避免高溫。