王潤(rùn)潤(rùn)，王東霞，張小微，楊巧玲，崔丹丹，張俊蓮，程李香

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

蛋白質(zhì)組用于各種細(xì)胞、組織中蛋白質(zhì)的研究.高分辨率的雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)已經(jīng)普遍用于各種植物組織蛋白質(zhì)的分離、分析以及鑒定.蛋白質(zhì)的提取是2-DE分析和鑒定的關(guān)鍵步驟.植物組織中通常含有厚細(xì)胞壁、高濃度有機(jī)酸的液泡以及大量的次生代謝物如色素、酚復(fù)合物，這些物質(zhì)嚴(yán)重干擾蛋白質(zhì)的提取和分離.因此，從植物組織中制備高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[1-2].最近研究結(jié)果表明，以苯酚提取法和TCA丙酮為基礎(chǔ)改善后的蛋白質(zhì)提取法能夠有效地提高富含多糖、脂質(zhì)和酚醛樹(shù)脂復(fù)合物以及高纖維的植物組織中2-DE的分別率、清除非蛋白質(zhì)的復(fù)合物、降低條紋的干擾[3-6].Lau等[7]采用苯酚/SDS結(jié)合醇酸銨沉淀法、 苯酚結(jié)合TCA/丙酮沉淀法和TCA/丙酮法提取植株葉綠體可溶性蛋白質(zhì)，結(jié)果表明苯酚/SDS結(jié)合醇酸銨沉淀法提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高，2-DE圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目最多.Al-Obaidi等[8]利用酚提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀與乙酸銨/甲醇沉淀相結(jié)合的方法提取靈芝防御相關(guān)蛋白質(zhì)，結(jié)果表明酚提取法是最適的靈芝屬蛋白質(zhì)提取方法.此外，融入二甲基亞砜或者尿素緩沖液的TCA/丙酮提取玉米根的蛋白質(zhì)較傳統(tǒng)的TCA/丙酮沉淀法明顯改善了2-DE圖譜分辨率、增加了蛋白點(diǎn)數(shù)目[10-11].因此，改善蛋白質(zhì)提取方法有利于植物蛋白質(zhì)攜帶信息的獲取.

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)塊莖作為儲(chǔ)藏器官具有細(xì)胞組織倍性一致的特點(diǎn)，是儲(chǔ)藏器官蛋白質(zhì)組研究的良好材料[12].但馬鈴薯塊莖細(xì)胞中含有大量的多酚、醌類和糖類等次生代謝物質(zhì)，用常規(guī)的蛋白質(zhì)提取方法不易去除干凈，不能有效提純和分離塊莖蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品的制備體系還不完善，雙向電泳效果差，干擾大.為了深入研究馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)組，選擇合適的馬鈴薯塊莖總蛋白質(zhì)提取方法是后續(xù)獲得高質(zhì)量的2-DE圖譜的關(guān)鍵.本試驗(yàn)根據(jù)馬鈴薯塊莖的特點(diǎn)，采用酚提取法和三氯乙酸/丙酮沉淀與乙酸銨/甲醇沉淀相結(jié)合的兩步沉淀法提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)，進(jìn)行2-DE分離，對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，探索適合馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)樣品制備的最佳方法.

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯普通栽培種‘大西洋’的成熟塊莖，采集于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，液氮速凍，于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?

1.2 主要試劑

IPG干膠條(Immobiline drystrip,pH3-10,17 cm)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；丙烯酰胺(Acr)、過(guò)硫酸銨(APS)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、考馬斯亮藍(lán)G-250(CBB G-250)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘氨酸(Glycine)、碘乙酰胺(IAA)、硫脲(Thiourea)、尿素(Urea)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、甘油、β-巰基乙醇、丙酮、醋酸銨、甲醇、溴酚藍(lán)為Amresco公司產(chǎn)品；Tris-飽和酚為Solarbio公司產(chǎn)品.所有溶液和緩沖液均為Milli-Q水配制.

1.3 樣品制備

1.3.1 粗蛋白提取 方法一：酚提取法 參照Al-Obaidi等[8]的方法略有改動(dòng).稱取2 g馬鈴薯塊莖，液氮研磨后，加入12 mL提取緩沖液(0.7 mol/L Sucrose,500 mmol/L Tris,30 mmol/L HCl,100 mmol/L KCl,50 mmol/L Ascorbic acid,2 mmol/L PMSF,pH 8.0)，冰浴30 min，4 ℃下12 000g離心15 min.取上清，加入15 mL Tris平衡酚，渦旋10 min，4 ℃下6 000g離心15 min.收集酚相加入5倍體積的0.1 mmol/L乙酸銨/甲醇溶液，-20 ℃沉淀過(guò)夜.4 ℃下12 000g離心10 min.沉淀加1 mL水懸浮，再加6 mL乙醇，-20 ℃沉淀過(guò)夜.沉淀加5 mL還原緩沖液 (8 mmol/L Urea,200 mmol/L Tris,2 mmol/L EDTA,20 mmmol/L DTT,pH 8.0)，溶解1 h后加入250 μL 0.5 mmol/L Tris，黑暗靜置30 min后加6倍體積的乙醇，4 ℃下12 000g離心10 min，沉淀經(jīng)真空干燥，得到的粗蛋白質(zhì)粉末進(jìn)行稱質(zhì)量后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?

方法二：兩步沉淀法 第一步沉淀為三氯乙酸/丙酮沉淀，根據(jù)Karppinen等[13]和Wang等[14]的方法略有改動(dòng).稱取2 g馬鈴薯塊莖，液氮研磨后，加入10 mL提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,25 mmol/L EDTA,500 mmol/L Thiourea,2 mmol/L PMSF,0.07% β-巰基乙醇,pH 8.0)，冰浴30 min，4 ℃下12 000g離心15 min.收集上清液，加入5倍體積預(yù)冷丙酮.渦旋振蕩后，-20 ℃沉淀過(guò)夜.4 ℃下12 000g離心20 min，沉淀重懸于等體積預(yù)冷丙酮溶液2次.4 ℃下12 000g離心15 min.第二步沉淀為乙酸銨/甲醇沉淀，根據(jù)Koistinen等[15]的方法略有改動(dòng).第一步沉淀樣品加6 mL 0.1 mmol/L Tris-HCl提取緩沖液 (pH8.0)，渦旋后4 ℃靜置20 min，加入等體積的水飽和酚，輕搖10 min.15 ℃下12 000g離心15 min，收集酚層溶液，加入12 mL 0.1 mmol/L乙酸銨/甲醇溶液.-20 ℃沉淀過(guò)夜.4 ℃下12 000g離心10 min.沉淀加入10 mL預(yù)冷丙酮溶液，渦旋振蕩后-20 ℃下靜置20 min.4 ℃下12 000g離心5 min，重復(fù)該步驟2遍.沉淀經(jīng)真空干燥，得到的粗蛋白質(zhì)粉末進(jìn)行稱質(zhì)量后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 蛋白質(zhì)提取 稱取粗蛋白質(zhì)干粉10 mg，以1∶20(mg/μL)加入樣品裂解液.渦旋振蕩后于30 ℃水浴2 h.4 ℃下12 000g離心15 min，上清液即為待分析的蛋白質(zhì)溶液，于-80 ℃保存用于雙向電泳分析.

1.4 蛋白質(zhì)定量

以牛血清白蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.取待分析上清液與蛋白試劑反應(yīng)5 min，595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度.

1.5 雙向凝膠電泳及2-DE圖譜分析

取含950 μg蛋白質(zhì)的上清液，用水化上樣緩沖液[7 ∶ Urea,2 ∶ Thioure,0.3% (w/v) DTT,2% (w/v) CHAPS,2% (v/v) Triton X-114,0.5% (v/v) IPG緩沖液,0.002% (w/v)溴酚藍(lán)]補(bǔ)至350 μL，充分混勻，4 ℃下12 000g離心10 min，進(jìn)行IEF上樣.將聚焦完成的膠條取出，置于含1% DTT或4%碘乙酰胺的平衡緩沖液[6 ∶ Urea,1.5 ∶ Tris-HCl,2% (w/v) SDS,20% (v/v)甘油，pH 8.8]各5 mL分別平衡15 min.待其平衡后，采用12%分離膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳.電泳結(jié)束后，CBB染色液染色20 h，去離子水浸泡脫色至背景清晰.凝膠采用UMAX Magicscan掃描儀掃描，光學(xué)分辨率300 dpi(Dot per inch)，保存為數(shù)字圖像.采用PDQuest 8.0.1軟件，對(duì)酚提取法和三氯乙酸/丙酮沉淀與乙酸銨/甲醇沉淀相結(jié)合的兩步沉淀法提取得到的蛋白質(zhì)凝膠圖像進(jìn)行匹配分析.標(biāo)記并切取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS分析.

1.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)獲得量及純度的比較

采用兩種提取方法對(duì)馬鈴薯塊莖所獲得的粗蛋白質(zhì)干質(zhì)量、純蛋白質(zhì)獲得量以及蛋白質(zhì)純度等進(jìn)行比較(表1).酚提取法獲得的粗蛋白質(zhì)量達(dá)到91.33 mg，是兩步沉淀法提取的3.71倍，而且純蛋白質(zhì)的獲得量也顯著高于兩步沉淀法，但是酚提取法獲得蛋白質(zhì)的純度和濃度卻明顯低于兩步沉淀法.

2.2 電泳結(jié)果的比較

2.2.1 雙向SDS-PAGE結(jié)果 利用酚提取法和兩步沉淀法提取的馬鈴薯塊莖總蛋白質(zhì)在17 cm pH 3～10非線性膠條進(jìn)行等點(diǎn)聚焦，然后用12%SDS-PAGE分離后獲得2-DE圖譜(圖1).兩步沉淀法所得雙向電泳圖譜(圖1-B)較酚提取法所得電泳圖譜(圖1-A)橫向紋理較少、蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)多且清晰可見(jiàn)，主要分布在pH值4～7范圍內(nèi)，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，分離效果比較理想，在pH 7～10的堿性區(qū)亦有較多顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn).而酚提取法2-DE電泳圖譜上在堿性區(qū)幾乎沒(méi)有清晰且呈橢圓的蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布.采用PDQuest 8.0.1軟件分析電泳圖譜，兩步沉淀法和酚提取法提取的馬鈴薯塊莖總蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目分別為398±46個(gè)和870±69個(gè).MALDI-TOF/TOF-MS鑒定了8個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)(表2)，分別是70 kU熱激相關(guān)蛋白質(zhì)，葉綠體、假定的線粒體NAD依賴的蘋(píng)果酸脫氫酶、烯醇酶類似物、脫氫抗壞血酸還原酶、蛋白酶抑制劑II前體類型B、成熟酶 K、酸性磷酸酶類似物和蛋白酶抑制劑1.這些被鑒定的蛋白質(zhì)可分為不同的功能類別，分別為能量和代謝相關(guān)蛋白質(zhì)(37.5%)、貯藏和防御相關(guān)蛋白質(zhì)(25%)、氧化還原相關(guān)蛋白質(zhì)(12.5%)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白質(zhì)(12.5%)和翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)(12.5%)(圖2).

表1 兩種提取方法獲得蛋白質(zhì)的比較

同列不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著.

Different small letters within the same column indicate that significant difference at 0.05 level.

圖1 酚提取法和兩步沉淀法提取的馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)2-DE圖譜Figure 1 2-DE profiles of potato tuber protein extracted with phenol extraction method and two-step precipitation extraction method

進(jìn)一步對(duì)獲得的8個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行比較分析(圖3)，結(jié)果表明兩步沉淀法中鑒定5種差異表達(dá)蛋白質(zhì)豐度顯著高于酚提取法，分別是70 kU 熱激相關(guān)蛋白,葉綠體、烯醇酶類似物、脫氫抗壞血酸還原酶和成熟酶K.此外，兩步沉淀法較酚提取法鑒定到一些新出現(xiàn)的蛋白質(zhì)包括假定的線粒體NAD依賴的蘋(píng)果酸脫氫酶、酸性磷酸酶類似物和蛋白酶抑制劑II前體類型B.

圖2 兩種提取方法下馬鈴薯塊莖差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類Figure 2 The functional classification of differentially expressed proteins of potato tuber extracted with two extraction methods

1809、2610、3819、5306、8001、8204、8210和6005分別是70 kU 熱激相關(guān)蛋白,葉綠體、假定的線粒體NAD依賴的蘋(píng)果酸脫氫酶、烯醇酶類似物、脫氫抗壞血酸還原酶、蛋白酶抑制劑II前體類型B、成熟酶K、酸性磷酸酶類似物和蛋白酶抑制劑1.圖3 兩種提取方法下馬鈴薯塊莖差異表達(dá)蛋白質(zhì)豐度比較Figure 3 The comparison of differentially expressed proteins abundance of potato tuber extracted with two extraction methods

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)被廣泛用于分析植物體各種生理生化機(jī)制[16].蛋白質(zhì)樣品的制備是2-DE的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響2-DE的分辨率和分離效果.目前，國(guó)際上普遍采用的一種蛋白質(zhì)提取方法是三氯乙酸/丙酮沉淀法，乙酸銨/甲醇沉淀法和酚提取法，單獨(dú)的每種方法操作簡(jiǎn)便并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于煙草(Nicotianatabacum)花粉[17]、水稻(Oryzasativa)根[18-19]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)葉片[20]和葡萄(Vitisvinifera)葉和根[21]、香蕉(Musaspp)和蘋(píng)果(Malusdomestica)[22]等組織的蛋白質(zhì)提取.但是，對(duì)于富含酚類、色素類、脂類以及有機(jī)酸等次生代謝物質(zhì)的材料，蛋白質(zhì)提取效果卻并不理想.三氯乙酸/丙酮沉淀法具有降低次生代謝物質(zhì)脂肪和色素的干擾、減少蛋白質(zhì)降解等優(yōu)點(diǎn)[23]，乙酸銨/甲醇沉淀法可有效去除樣品中的可溶性雜質(zhì)[13].本試驗(yàn)將三氯乙酸/丙酮沉淀和乙酸銨/甲醇沉淀結(jié)合在一起的兩步沉淀法提取的蛋白質(zhì)和酚提取法提取的蛋白質(zhì)比較，兩步沉淀法提取的蛋白質(zhì)的含量較低，但其蛋白質(zhì)純度和濃度顯著增加，說(shuō)明三氯乙酸/丙酮沉淀與乙酸銨/甲醇沉淀相結(jié)合的兩步沉淀法比酚提取法提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)更有效，除雜效果更徹底.用酚提取法提取蛋白質(zhì)時(shí)，由于只收集酚相，大量的沉淀物被丟棄，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的損失較多[24].經(jīng)質(zhì)譜分析兩步沉淀法和酚提取法表達(dá)量在2.5倍以上的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，主要富集在堿性區(qū)(pH 7～10)，包括酸性磷酸酶類似物、成熟酶、烯醇酶類似物、假定的線粒體NAD依賴的蘋(píng)果酸脫氫酶，與Delaplace等[25]采用酚提取法提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)經(jīng)2-DE分離后蛋白質(zhì)主要富集在酸性區(qū)(pH 4～7)相比，兩步沉淀法大大提高了馬鈴薯塊莖堿性區(qū)蛋白質(zhì)的收集，改善了酚提取法堿性區(qū)蛋白質(zhì)損失多的特性.

4 結(jié)論

采用酚提取法和三氯乙酸/丙酮沉淀與乙酸銨/甲醇沉淀相結(jié)合的兩步沉淀法提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)2-DE圖譜分析發(fā)現(xiàn)兩步沉淀法提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量增加且蛋白質(zhì)點(diǎn)分離效果好.該方法具有更好的除雜效果和高效富集堿性區(qū)域蛋白質(zhì)的作用，是提取馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的最佳方法，為研究馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)組學(xué)提供了更完善的技術(shù)支撐.