祁磊，張全偉，王琪，李宗帥，杜嘉祥，張勇，崔煥忠

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

1962年，CARPER[1]等首次在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一類(lèi)高度保守蛋白，即熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs).HSPs是機(jī)體細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境中物理、化學(xué)、生物等因素刺激時(shí)，選擇性合成的一類(lèi)保護(hù)蛋白[2].正常生理?xiàng)l件下，HSPs參與調(diào)控?zé)釕?yīng)激反應(yīng)，此外，HSPs作為分子伴侶，還參與了一些重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，如蛋白轉(zhuǎn)位，裝配和折疊[3]等.根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小，將HSPs分為小分子HSP、HSP40、HSP60、HSP90、HSP110和泛素等6個(gè)亞類(lèi).其中HSP60作為HSPs家族中最為保守的亞類(lèi)，廣泛存在于真核生物及原核生物中， 發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4].與該家族其他成員類(lèi)似，HSP60參與新生肽鏈的結(jié)合與穩(wěn)定，對(duì)變性蛋白有修復(fù)或加速其降解的作用.在冷、熱、缺氧、有機(jī)毒物，重金屬等體外環(huán)境應(yīng)激下，HSP60表達(dá)明顯增加，且發(fā)生移位[5].孫培明等[6]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體受熱刺激時(shí)，HSP27、HSP60、HSP70和HSP86在心肌細(xì)胞中表達(dá)定位存在差異，但均可見(jiàn)免疫陽(yáng)性表達(dá)，結(jié)果提示HSPs可能對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)發(fā)揮重要作用.于紀(jì)棉[7]等發(fā)現(xiàn)，HSP60在肉雞抗逆過(guò)程中具有重要意義，是心肌細(xì)胞在熱應(yīng)激初期反映損傷大小的重要分子標(biāo)志.真核生物中，HSP60主要存在于線粒體中，少部分存在于胞漿內(nèi)，線粒體中HSP60高表達(dá)對(duì)細(xì)胞抗凋亡發(fā)揮重要的作用，其表達(dá)量的高低直接影響線粒體內(nèi)促凋亡因子和抗凋亡因子的表達(dá)[8].原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，通過(guò)免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)HSP60與Bcl-xl和Bax表達(dá)密切有關(guān)，當(dāng)該通路激活時(shí)，HSP60表達(dá)上調(diào)，使得抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-xl)的表達(dá)隨之上調(diào)，而促凋亡因子(Bax和Bad)的表達(dá)則下調(diào)，影響細(xì)胞凋亡[9].近年來(lái)，HSP60基因已成為HSPs家族中的研究熱點(diǎn).目前，已見(jiàn)雞[10]、鼠[11]、人[12]等有機(jī)體中HSP60的報(bào)道，但綿羊HSP60的功能至今未見(jiàn)報(bào)道.

‘岷縣黑裘皮羊’是我國(guó)一種極為重要的地方綿羊品種，主要分布于甘肅境內(nèi)洮河兩岸，又以岷縣居多，其肉質(zhì)鮮嫩，皮毛質(zhì)地優(yōu)良.近年來(lái)，純種‘岷縣黑裘皮羊’數(shù)量有明顯的消減趨勢(shì)，且日益嚴(yán)重的病害問(wèn)題和不斷惡化的自然條件給‘岷縣黑裘皮羊’養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[13].HSPs是生物體內(nèi)的重要抗感染和抗逆基因,‘岷縣黑裘皮羊’HSP60的深入研究可有助于‘岷縣黑裘皮羊’養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展.本試驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)和Western-blotting的方法檢測(cè)HSP60基因在綿羊各組織中的表達(dá)分布和表達(dá)差異，有助于深入了解其作用，為進(jìn)一步研究HSP60基因在綿羊抗逆性上提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 健康雄性‘岷縣黑裘皮羊’(2歲，n=3)，屠宰后分別采集心臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸和肌肉組織，部分組織迅速保存于液氮中；部分組織置于4%多聚甲醛固定保存.

1.1.2 主要試劑 HSP60抗體購(gòu)自Santa公司(mouse polyclonal to HSP60，sc-59567)，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo公司，SYBR Green qPCR Mastermix購(gòu)自DBI公司，DAB顯色試劑盒和免疫組化試劑盒(Code:SP-0022)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，TransZOL UP RNA提取試劑盒(code：ET111-01)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司,高效RIPA裂解液(code：R0010)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(code：P0012)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以GeneBank公布的綿羊HSP60mRNA序列為參照，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1).

Trizol法提取各組織Total RNA，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，以其為模板，對(duì)‘岷縣黑裘皮羊’HSP60基因表達(dá)檢測(cè).反應(yīng)體系為20 μL： cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、2×TranStart Tip Green qPCR SuperMix10 μL、ddH20 8 μL.擴(kuò)增程序采用三步法：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s；共45個(gè)循環(huán).具體步驟參照文獻(xiàn)[14].每個(gè)樣品重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增曲線和溶解曲線用于判定，采集Ct值，結(jié)果采用2-△△ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

表1 HSP60和β-actin基因引物序列信息

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 4%多聚甲醛溶液固定的組織經(jīng)石蠟包埋、組織切片、烤片、脫蠟、抗原修復(fù)后；經(jīng)3% H2O2室溫孵育30 min；鼠源HSP60一抗(1∶300)4 ℃孵育過(guò)夜；陰性對(duì)照用PBS代替一抗；二抗(1∶2 000)37 ℃孵育30 min；DAB顯色、蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精返藍(lán)；二甲苯透明、油性樹(shù)脂封片.隨機(jī)選取10個(gè)視野，Image-Pro Plus 6.0軟件掃描其灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.2.3 蛋白免疫印跡 RIPA法提取各組織總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣量為30 μg，80 V恒壓電泳，電轉(zhuǎn)移法(100 v恒壓，100 min)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，鼠抗HSP60(1∶3 000)和兔抗β-actin(1∶2 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜；次日，兔抗鼠和羊抗兔二抗(1∶4 000)

37 ℃孵育3 h，化學(xué)發(fā)光法ECL顯影并于暗室曝光.經(jīng)Image J軟件掃描其灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘岷縣黑裘皮羊’不同組織HSP60mRNA表達(dá)

根據(jù)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增‘岷縣黑裘皮羊’HSP60和β-actin序列，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在246 bp和184 bp處可見(jiàn)單一明亮的條帶(圖1-A).結(jié)果可排除引物二聚體對(duì)目的基因△Ct值得影響.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示HSP60mRNA在6個(gè)組織中均有表達(dá)，心臟組織中HSP60表達(dá)量明顯高于其他組織(P<0.01)，隨后依次為肺臟、腎臟、睪丸和肌肉，脾臟表達(dá)量最低(圖1-B).結(jié)果表明HSP60在綿羊各組織器官中的表達(dá)存在差異性，從心臟組織中的表達(dá)量推測(cè)HSP60可能對(duì)保護(hù)心肌細(xì)胞起重要作用.

A：HSP60基因和內(nèi)參基因β-actin基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果B：綿羊不同組織器官中HSP60 mRNA的相對(duì)表達(dá)量；M:Marker 750bp.不同字母肩標(biāo)表示組間差異極顯著(P<0.01)；相同字母肩標(biāo)表示組間差異不顯著(P>0.05).A:The PCR results of HSP60 and β-actin，B:Relative HSP60 mRNA expression in different tissues and organs of sheep；M:Marker 750 bp.The different letters mean significant difference between the groups(P<0.01);The same letters mean no difference between the groups(P>0.05).圖1 ‘岷縣黑裘皮羊’不同組織HSP60 mRNA表達(dá)水平Figure 1 The mRNA expression level of HSP60 in different tissues of sheep

2.2 ‘岷縣黑裘皮羊’不同組織中HSP60蛋白表達(dá)與定位

免疫組織化學(xué)染色對(duì)‘岷縣黑裘皮羊’不同組織中HSP60蛋白進(jìn)行表達(dá)定位研究，結(jié)果顯示，‘岷縣黑裘皮羊’心臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和睪丸組織中均有HSP60陽(yáng)性表達(dá)(圖2).其中，在綿羊心肌纖維胞漿、脾臟邊緣區(qū)、紅髓、假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺臟平滑肌、腎小體周?chē)?、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞均有HSP60陽(yáng)性反應(yīng)，且著色深淺不一，陰性對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng).根據(jù)積分光密度值比較得出HSP60蛋白的陽(yáng)性表達(dá)量在心臟中最高，肺臟、腎臟、睪丸和肌肉表達(dá)量次之，而脾臟表達(dá)量最低(圖3).

A-C1免疫組化染色(A1、B1、C1為腎臟、睪丸、心臟陰性對(duì)照);A.心臟(CC:心肌細(xì)胞);B.脾臟 (SN:脾小結(jié) RP：紅髓);C.肺臟(PCCE:假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮 PA:肺動(dòng)脈);D.腎臟(RC:腎小體 DT:遠(yuǎn)曲小管 PT:近曲小管);E.睪丸(S:精原細(xì)胞 PS:初級(jí)精母細(xì)胞);F.肌肉(SM:骨骼肌細(xì)胞).A-C1 Immunohistochemical staining (A1、B1、C1 as a negative control of testis);A.heart (CC:cardiac cells);B.spleen (SN:splenic corpuscle RP:spleen red pulp);C.lung (PCCE:pseudostratified ciliated columnar epithelium PA:pulmonary artery );D.kidney (RC:renal cortical tubules DT:distal convoluted tubule PT:proximal convoluted tubule);E.testis (S:spermatogonia PS:primary spermatocytes；F.muscle (SM:skeletal muscle cells).圖 2 ‘岷縣黑裘皮羊’不同組織中HSP60蛋白表達(dá)與定位Figure 2 Expression and Immuno-localization analysis of HSP60 in sheep tissues

不同字母表示組間差異極顯著(P<0.01)；相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05).The different letters mean significant difference between the groups(P<0.01);the same letters mean no difference between the groups(P>0.05).圖3 綿羊不同組織器官中HSP60陽(yáng)性反應(yīng)的積分光密度值Figure 3 Integrated optical density of HSP60 expression in different sheep tissues

2.3 ‘岷縣黑裘皮羊’不同組織中HSP60蛋白表達(dá)

Western-Blotting結(jié)果顯示：‘岷縣黑裘皮羊’不同組織器官中均可見(jiàn)HSP60蛋白的差異表達(dá)(圖4-A)，與其它組織相比較，心臟組織中HSP60蛋白

相對(duì)表達(dá)量最高且差異極顯著 (P<0.01)，脾臟表達(dá)量最低(圖4-B).免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的結(jié)果基本一致，結(jié)果均表明HSP60的相對(duì)表達(dá)量在‘岷縣黑裘皮羊’的各組織中存在差異性差異，且心臟組織中表達(dá)量最高.

3 討論

HSP60在細(xì)胞周期和細(xì)胞程序性死亡等進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其具體功能和作用機(jī)制仍不清楚.目前，已有關(guān)于雞、鼠、人等機(jī)體HSP60的報(bào)道，但‘岷縣黑裘皮羊’HSP60的功能至今未見(jiàn)報(bào)道.本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化和Western-Blotting 3種經(jīng)典方法從基因和蛋白水平探究‘岷縣黑裘皮羊’各組織器官中HSP60表達(dá)的差異性及規(guī)律.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：‘岷縣黑裘皮羊’各組織器官中HSP60基因表達(dá)存在差異表達(dá)，其中心臟中表達(dá)量明顯高于其他組織，肺臟、腎臟、睪丸和肌肉表達(dá)量次之，脾臟表達(dá)量最低.據(jù)此，推測(cè)HSP60在保護(hù)心臟完整性發(fā)揮關(guān)鍵作用[15.Gullo等[16]表明，HSP60可作為心肌細(xì)胞損傷和心力衰竭過(guò)程的早期啟動(dòng)器.機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下HSP60表達(dá)量顯著上調(diào)，這可能與心臟ATP生成需求增加，心臟收縮率提高等密切相關(guān)[17].免疫組化染色發(fā)現(xiàn)心肌纖維的胞漿內(nèi)呈現(xiàn)較明顯的HSP60陽(yáng)性反應(yīng)，而細(xì)胞核內(nèi)幾乎未見(jiàn)其表達(dá)，提示HSP60的表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞正常生理活動(dòng)有重要意義.李士澤等[18]通過(guò)Western-blotting檢測(cè)冷應(yīng)激后脾臟HSP70的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著冷應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，脾臟中HSP70的表達(dá)持續(xù)上調(diào).陳玲等[19]發(fā)現(xiàn)急性冷刺激大鼠心肌組織、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞，在冷刺激初期，心肌組織、淋巴細(xì)胞中HSP90蛋白表達(dá)明顯升高，脾臟在冷刺激初期蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化.本試驗(yàn)中，HSP60陽(yáng)性反應(yīng)僅發(fā)生在紅髓和脾臟邊緣區(qū)，推測(cè)HSP60與體液免疫應(yīng)答相關(guān).Cohen等[20]在豚鼠肺上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多種HSPs大量表達(dá)，提出HSPs在呼吸細(xì)胞抵抗逆環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵作用.Koh等[21]報(bào)道誘導(dǎo)HSPs的高表達(dá)，可保護(hù)肺臟組織.本試驗(yàn)中，免疫組化的結(jié)果顯示，‘岷縣黑裘皮羊’假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺臟平滑肌均有HSP60陽(yáng)性表達(dá)，提示HSP60的表達(dá)可能與提高肺臟組織抗逆性有關(guān).郭瓊梅[22]等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)腎臟進(jìn)行缺血處理后，HSPs的高表達(dá)會(huì)減輕缺血再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)腎臟的作用.楊潔[23]等發(fā)現(xiàn)在過(guò)度訓(xùn)練的大鼠腎組織中，HSP70表達(dá)量顯著上升，且通過(guò)免疫組織化學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)表達(dá)明顯低于髓質(zhì).本試驗(yàn)中，免疫組化的結(jié)果顯示，綿羊腎臟近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、腎小體周?chē)嘘?yáng)性表達(dá)，推測(cè)HSP60對(duì)維持血液的酸堿平衡有重要作用.朱曄敏[24]等發(fā)現(xiàn)，HSP60在雄性動(dòng)物的精子發(fā)生、精子獲能中有積極作用.在精原細(xì)胞分化成為精子的過(guò)程中，HSP60表達(dá)量在有絲分裂期會(huì)顯著增加[25].本試驗(yàn)中，免疫組化的結(jié)果顯示，綿羊精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞中均有HSP60陽(yáng)性表達(dá)，提示HSP60的表達(dá)可能與睪丸的生殖功能有關(guān).

A:Western-blotting檢測(cè)HSP60蛋白在綿羊不同組織器官中的表達(dá),B:綿羊不同組織器官中HSP60蛋白免疫印跡光密度度值,不同字母表示組間差異極顯著(P<0.01)；相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05).A:Western blot assays of HSP60 protein in different tissues and organs of sheep,B:The average optical density of the HSP60 protein in different tissues and organs of sheep,the different letters mean significant difference between the groups(P<0.01);the same letters mean no difference between the groups(P>0.05).圖4 綿羊不同組織中HSP60蛋白表達(dá)檢測(cè)Figure 4 The expression level of HSP60 protein in different sheep tissues

本研究證明了HSP60基因在‘岷縣黑裘皮羊’各組織器官中存在差異表達(dá)，心臟中HSP60基因和蛋白的表達(dá)最高.結(jié)果表明，HSP60可能對(duì)維持心臟或心肌細(xì)胞的功能具有重要調(diào)節(jié)作用，但其具體作用還有待于進(jìn)一步研究.